POTENCIAL BIOTECNOLOGICO DE BACTÉRIAS DA CAATINGA PRODUTORAS DE CMCASE E L-ASPARAGINASE

ISBN 978-85-85905-10-1

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Oliveira, W. (UPE) ; Lucas, I. (UFPE) ; Alves, L. (UFPE/UFAM) ; Laís de Sousa, W. (UFPE)

Resumo

Na rizosfera, observa-se uma intensa atividade microbiana, em razão da presença de exsudatos e secreções radiculares que representam as maiores fontes de carbono prontamente disponíveis para os micro-organismos. O objetivo deste trabalho foi isolar micro-organismos da rizosfera da Catingueira e quantificar a atividade enzimática dos isolados produtores de enzimas, CMCase e L-asparaginase, produzidas em meio líquido de fermentação. As condições tempo de fermentação foram determinadas em função da resposta da atividade enzimática de fermentação (24, 48, 72, 96 e 120 horas). As mesmas foram realizadas sobre agitação de 120 rpm a 37ºC. Os resultados demonstram que a maior produção para a CMCase pela bactéria M5 foi de 0,1228 U/mg de proteina em 48 horas de fermentação, enquanto que para a L-as

Palavras chaves

Bactérias; Catingueira; Fermentação

Introdução

Com o desenvolvimento de processos biotecnológicos indo de encontros com as normas de políticas ambientais, necessitando assim de substituição dos processos químicos convencionais por processos enzimáticos a fim de aprimorar a tecnologia atual. As enzimas podem ser encontradas no solo na forma livre, excretadas por células vivas (exoenzimas), liberadas por células que se rompem (endoenzimas) e enzimas ligadas a constituintes celulares (SILVA et al., 2012). Dentre as enzimas, a Celulases e a L-asparaginases, tem apresentado significativa importância biotecnológica. As Celulases são biocatalisadores altamente específicos que atuam em sinergia para a liberação de açúcares, podem ser classificadas, de acordo com seu local de atuação no substrato celulósico, as divide em três grandes gru¬pos: endoglucanases (EnG), que clivam ligações internas da fibra celulósica; exoglucanases (ExG), que atuam na região externa da celulose; e - glicosidases (BG), que hidrolisam oligossacarídeos solúveis em glicose (CASTRO; PEREIRA JR, 2010). A L-asparaginase (L-asparagina aminohidrolase), é a enzima que converte a L-asparagina em ácido L-aspártico e amônia, a qual tem sido usada como um agente quimioterapêutico. O manejo clínico desta enzima é atribuído à redução de L- asparagina, impossibilitando as células tumorais de sintetizar este aminoácido e consequentemente morte destas células. (AMENA, 2010). Com base na especificidade do substrato, L-amidohidrolases bacterianas podem ser divididas em duas grandes classes. A primeira classe, representada pelas asparaginases que utilizam primariamente L-asparagina como substrato. E a segunda classe, também chamada de gutaminase-asparaginases, catalisam a hidrólise de L-asparagina e L- glutamina. (AGHAIYPOUR et al., 2001). Verificando-se crescente

Material e métodos

Amostra da rizosfera da Catingueira no período de inverno serviu de base para o isolamento bacteriano. A amostra foi preparada e diluída em soluções salinas de NaCl a 0,9% (p/v) esterilizadas, nas concentrações 10-3, 10-4 e 10-5, inoculadas em triplicata nos meios específicos para crescimento bacteriológico (Tryptic Soy Agar e Ágar Nutritivo), purificadas e preservadas em óleo mineral (KING et al., 1954). Para avaliar a capacidade das referidas bactérias em degradar a celulose, estas foram inoculadas em meio sólido contendo sais e Carboximetilcelulose (1%) como fonte de carbono, posteriormente foram incubadas a 370C por 24 e/ou 48 horas, e avaliadas quanto à capacidade de degradar a celulose após a revelação com a solução de vermelho congo 5% (QUEIROZ et al., 2002). A Triagem das bactérias produtoras de L-asparaginase foi desenvolvida utilizando o meio M- 9 modificado contendo L-asparagina a 1% e vermelho de fenol como indicador (GULATI et al., 1997). Após selecionar as melhores bactérias produtora do complexo celulolítico e produtoras de L-asparaginase, foram realizadas cinéticas enzimáticas para avaliar o melhor tempo de produção dos complexos enzimáticos, utilizando carboximetilcelulose como substrato indutor para Celulases e L-asparagina como substrato indutor L- Asparaginase, em fermentações submersas nos seus respectivos meios de seleção. Na pré-fermentação foi inoculada alçadas da colônia cultivada (ERNANDES et al., 2003), em meio de crescimento caldo Muller Hington e incubadas sob agitação de 120 rpm por 24h. As fermentações realizadas em triplicada utilizando frascos de Erlenmeyer de 250 mL, com 50 mL dos meios CMC 2% e M-9, e inoculados com o pré-inóculo em uma proporção de 10% (v/v) (MEIRA, 2007). Em seguida os foram frascos incubados sob agitação de 120 rpm

Resultado e discussão

Dentre as 47 amostras bactérias isolados a rizosfera da catingueira no período de inverno, 28% das amostras apresentaram atividades celuloliticas, se destacando as bactérias: BA-1 com índice enzimático 4,5; M-5 com índice enzimático 2,54 e T-2 com índice enzimático 2,65, sendo estes micro- organismos selecionados para realização da cinética de em cultivos submersos sob agitação, sendo detectadas apenas atividades celuloliticas significativas na fermentação com o isolado bacteriano designado M5. Na Figura 1 estão apresentados os valores de atividade CMCase em U/mL e U/mg de proteína em função do tempo de cultivo, apresentando um pico de produção com 48 horas de cultivos (0,0084 U/mL e 0,1228 U/mg de proteína).No screening para os ensaios de L-asparaginase, 13 foram positivas para a produção de L-asparaginase quando comparadas a Escherichia coli, utilizada no referido trabalho como controle positivo. Das quais duas linhagens (I4 e I5) se destacaram, apresentando uma produção enzimática num período de 24 horas, superior ao controle positivo. Para avaliar o melhor tempo de cultivo para a excreção da enzima L-asparaginase, as referidas linhagens foram submetidas a fermentações liquidas sob agitação, estes dados estão presentes nas Figuras 2. No presente trabalho observa-se que a linhagem I4 apresentou um pico de produção com 48 horas de cultivo correspondente a 121,79 U/mL e 1487,93 U/mg de proteína com 72 horas de cultivo. Entretanto a linhagem I5 excretou 137,79 U/mL e 3476,091 U/mg de proteína com apenas 24 horas de cultivo. Portanto, os resultados obtidos no presente estudo indicam uma alta incidência de atividade asparaginásica, sugerindo que a maioria das linhagens produzem L–asparaginase tipo I, com alta afinidade pelo substrato L- asparagina.

: Cinetica de produção de CMCase de M5


Cinetica de produção a) de L-asparaginase de I4 b) L-asparaginase de I5

Conclusões

Com os dados obtidos no presente estudo, evidenciou um potencial biotecnológico e farmacológico dos micro-organismos isolados, bem como a importância sobre o estudo da microbiota dos diferentes ecossistemas. Evidenciando a necessidade da realização de experimentos quanto à produção e caracterização das referidas enzimas excretadas por bactérias isoladas da rizosfera da Catingueira no período de inverno.

Agradecimentos

Referências

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