ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DE BACTÉRIAS DO GÊNERO BACILLUS COM POTENCIAL PARA PRODUÇÃO DO BIOAROMA ACETOÍNA.

ISBN 978-85-85905-10-1

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Oliveira, D.N.A. (UFPE) ; Correia, J. (UFPE) ; Marques, O. (UFPE) ; Silva, I.J.S. (UFPE) ; Trindade, F.C.S. (UFPE) ; Pereira, Y. (UFPE)

Resumo

Este trabalho teve como objetivo, isolar e identificar bactérias do gênero Bacillus, a partir de sedimentos de mangue, a fim de realizar um levantamento do potencial para produção de bioaroma de acetoína. As amostras foram coletadas em 04 pontos equidistantes das margens da Lagoa do Araçá em Recife-PE, diluídas e submetidas a 100ºC a fim de selecionar bactérias esporuladas. Alíquotas de 1 ml das diluições foram semeadas pela técnica “Pour-Plate”, em Agar Nutritivo com 2% de amido e NaCl e incubadas por 48hs a 35°C. Colônias com aspectos morfológicos diferentes foram isoladas e submetidas à coloração de Gram e esporos. Foram obtidas 31 cepas de bacilos (Gram +; esporulados) e através de testes de bioquímicos foram identificadas 9 espécies do gênero Bacillus, sendo 5 produtoras de acetoína.

Palavras chaves

Acetoína; Bacillus; Mangue

Introdução

Os manguezais são ecossistemas de transição entre os ambientes terrestres e marinhos. Possui uma estreita relação com ambientes predominantemente lodosos, oriundos da deposição de sedimentos finos, de fundos de baias e estuários e apresentam fauna e flora complexas, que associadas aos manguezais proporcionam um ambiente de alta biodiversidade. Estima-se que, em todo planeta, existam cerca de 172.000 km2 de manguezais e desse total, 15% distribuem-se pelo litoral do Brasil. Em Pernambuco existem cerca de 270 km2 e dentre eles encontra-se o manguezal da Imbiribeira, localizado entre os rios Jordão e Tejipió. Esse manguezal está numa área habitada e tem solo úmido, salgado, lodoso, com elevada concentração de compostos orgânicos e inorgânicos provenientes de despejos residenciais. Sendo um ambiente tão peculiar apresenta microrganismos específicos adaptados àquela condição (Aguiar, 2007). Os microrganismos têm sido bastante explorados na elaboração de diversos produtos biotecnológicos. A acetoína (3-hidroxi-2-butanona) é uma cetona de odor agradável de elevado potencial de aplicação nas indústrias de alimentos atuando como potencializador de aromas para manteiga, queijo, vinagre e café (Teixeira, 1999). Estudos bibliográficos revelam que leveduras e bactérias podem ser capazes de produzir acetoína salientando-se que dentre eles as bactérias, principalmente as do gênero Bacillus, são grandes produtoras (Costelli, 2005). Considerando ainda que os Bacillus têm como principal habitat o solo e que é importante buscar novas cepas produtoras em diferentes ambientes e levando em consideração que existem poucos estudos relacionados a solos de mangues, o presente estudo se propôs isolar bactérias do gênero Bacillus, produtores de acetoína do sedimento do solo da lagoa do Araçá-PE.

Material e métodos

Isolamento dos Microrganismos: As amostras foram coletas do sedimento a 10 cm de profundidade em 4 pontos no entorno do mangue da Lagoa do Araçá, posicionados, nas coordenadas geográficas: -8.092984, -34.913373; -8.093095, -34.916334; -8.093095, -34.916334; -8.093095, -34.916334 e nomeados pelas letras A, B, C e D. As amostras foram acondicionadas em sacos estéreis e levadas ao laboratório, em seguida 25g de cada amostra foi transferida assepticamente para frascos com 225ml de água salina peptonada a 0,85%. As suspensões foram levadas à fervura e após o esfriamento, feitas as diluições 1/10, 1/102, 1/103. A seguir 1mL das amostras foram inoculadas pela técnica “Pour Plate” em Agar Nutritivo com 2% de NaCl e 0,2% de amido e incubadas por 48hs a 35°C. As colônias isoladas de cada ponto foram transferidas para tubos de ensaio e nomeadas com referências dos pontos de onde foram retiradas (A, B, C, D) e numeração (1 – 10). Todas as culturas isoladas em tubos de ensaio foram armazenadas em refrigerador a 5oC e repicadas no momento dos ensaios. Métodos de caracterização: A caracterização das cepas baseou-se na chave contida em Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (2005). Previamente, as bactérias foram analisadas pela coloração diferencial de Gram e os bacilos foram diferenciados quanto à forma como bacilos longos, curtos, grossos, finos. Uma coloração subsequente foi realizada para identificação e caracterização dos esporos. A partir daí, a definição das espécies foi feita por testes bioquímicos variados como fermentação de açúcares, enzimáticos, teste do vermelho de metila, teste de tolerância ao NaCl 6,5% e teste de Vogues-Proskauer (VP) para avaliar a habilidade das bactérias em produzir acetoína (Hankin e Anagnostakis,1979; Kitancharoen e Hatai,1998; ANVISA,2004)

Resultado e discussão

Foram isoladas 40 cepas de bactérias aeróbias das quais 31 (77,5%) foram identificadas como bacilos Gram positivos esporulados, caracterizadas assim como pertencentes ao gênero Bacillus. Após essa triagem os Bacillus foram submetidos ao teste bioquímico enzimático para produção da amilase, e separados em dois grupos (amilase + e amilase -). Foi constatado pela hidrólise do amido que 59% das amostras apresentaram atividade amilásica. As espécies foram então identificadas por reações específicas (segundo a chave de caracterização da Figura 1), sendo obtidas 9 espécies de microrganismos desse gênero (Tabela1). Foi possível observar que dentre os isolados havia uma maior presença das espécies B. licheniformis (19,35%) e B. polymyxa (19,35%) e que as mesmas se encontravam presentes em todos os pontos de coleta; indicando que há uma presença abundante destes microrganismos naquele ambiente. O B. subtilis (16,13%) também foi abundante, mas não foi isolado no ponto D de coleta. Segundo Gomes (2013) o gênero Bacillus é composto de microrganismos ambientais cujo habitat principal é o solo onde possuem um papel importante no ciclo do carbono e do azoto. A resistência dos esporos e a diversidade fisiológica das formas vegetativas fazem com que sejam considerados ubíquos, podendo ser isolados do solo, da água e gêneros alimentícios. Este trabalho confirma a grande diversidade desses microrganismos no ambiente do solo e em especial do solo do mangue estudado. A avaliação da habilidade das bactérias para produção de acetoína foi feita segundo o teste de Voges Proskauer (ANVISA,2004). O resultado do teste indicou que 5 espécies apresentaram resultado positivo. As espécies produtoras do bioaroma foram: B. subtilis, B.licheniformis, B. polymyxa, B. alvei e B. coagulans.

Fluxograma de identificação para bactérias do Gênero Bacillus segundo Bergey (2005)


Espécies de Bacillus encontrados nos pontos de coleta do solo do entorno da Lagoa do Araça - Recife

Conclusões

Os mangues, apesar de pouco valorizados, são ambientes de alta biodiversidade apresentando flora microbiana muito rica e por isso necessitam de uma observação mais acurada. Na Lagoa do Araçá foram identificadas 9 espécies distintas, do gênero Bacillus, que apresentam alto potencial biotecnológico, dentre as quais 5 são produtoras de bioaroma de acetoína. As espécies produtoras do bioaroma são: B. subtilis, B. licheniformis, B. polymyxa, B. alvei e B. coagulans. Portanto, fica assim demonstrada a pluralidade desse ecossistema e a perspectiva de contribuição a nível industrial e tecnológico.

Agradecimentos

À Universidade Federal de Pernambuco e especial ao Departamento de Engenharia Química que forneceu os meios materiais para o desenvolvimento deste trabalho.

Referências

AGUIAR, E. C. Avaliação Quantitativa das Áreas de Manguezais do Recife utilizando Imagens de Satélite como Tecnologia de Apoio. Dissertação de Mestrado, ITEP, 2007.

TEIXEIRA, R. M. ; CAVALHEIRO, D. ; NINOW, J. L. ; FURIGO JÚNIOR, A. . Estudo dos efeitos das condições de cultura na produção de acetoína por Hanseniaspora guilliermondii. In: II Encontro de Engenharia de Processos do Mercosul - Enpromer'99, 1999, Florianópolis, 1999.
COSTELLI, M. C. ; MÜLLER, K. J. ; LUERCE, R. de F. ; FURIGO JR, A. . Influência do pH Inicial e do Tempo de Cultivo do Inóculo na produção de Acetoína por Bacillus polymyxa. Acta Ambiental Catarinense, Chapecó - SC, v. 3, p. 55-64, 2005.

Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd Ed. Volume 2:., Editor-in Chief. David R. Boone and Richard W. Castenholz, Editors. Springer: New York. 2005


HANKIN, L. & ANAGNOSTAKIS, S.L. The use of solid media for detection of enzyme production by fungi. Mycologia 67:597-607. 1979.

KITANCHAROEN, N. & HATAI, K. - Some Biochemical Characteristics of Fungi Isolated from Samonid Eggs. Mycoscience, 39. 1998.

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos- Módulo IV, 2004.