Biomarcadores Proteicos de Mercúrio em Tecido Hepático de Peixe Jaraqui (Semaprochilodus sp) do Rio Madeira/Brasil

ISBN 978-85-85905-10-1

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Cavalcante Souza Vieira, J. (UNESP) ; Pereira Braga, C. (UNESP) ; Cavecci, B. (UNESP) ; Correia Bitarello, A. (UNESP) ; Queiroz, J.V. (UNESP) ; Magalhães Padilha, P. (UNESP)

Resumo

Resumo O Hg é um elemento químico potencialmente tóxico para os seres vivos, quando bioacumulado no organismo, pode se ligar a proteínas e/ou enzimas inativando-as e até mesmo causar danos a níveis cromossômicos. Os peixes da região amazônica vêm demonstrando níveis consideráveis de Hg ligado a suas proteínas. Para o fracionamento e caracterização dessas proteínas, usamos técnicas de 2D -PAGE e ESI-MS que permitiram caracterizar sete proteínas do tecido hepático de jaraqui ligadas ao mercúrio, que podem ser consideradas como biomarcadores desse metal em peixes da região da Usina Hidrelétrica de Jirau, Bacia do Rio Madeira/ Rondônia. Para quantificação do Hg foi utilizado espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS).

Palavras chaves

biomarcador; ESI-MS; proteína.

Introdução

Introdução O uso do mercúrio (Hg) na mineração de ouro na região amazônica até a década de 80 foi muito intenso e seus efeitos na biota aquática persistem até hoje. Sua ampla disposição nos ecossistemas aquáticos resulta tanto de atividades antrópicas quanto de processos naturais. Um dos primeiros passos em direção a bioacumulação de mercúrio em cadeias alimentares aquáticas é a metilação das formas inorgânicas do metal, um processo que é mediado principalmente por bactérias anaeróbicas. Nos seres humanos, o Hg age como uma neurotoxina potente, principalmente, se o metal estiver na forma metilada e dependendo da sua concentração nos tecidos, pode ocorrer desnaturação de proteínas, inativação de enzimas e alteração da atividade celular (JESUS et al., 2008). A contaminação por Hg tem sido reconhecida como uma questão importante desde o início da década de 1970, e hoje em dia, há uma abundância de evidências de que este metal onipresente é um dos mais tóxicos para os organismos vivos (MELA et al., 2013). Existem várias formas químicas do Hg no ambiente natural; sendo que, dentre os compostos de Hg, o metilmercúrio (MeHg) é o mais importante em termos de toxicidade e efeitos na saúde (QIU et al., 2009). A principal via de absorção de peixes é dietética (SCUDDER et al., 2009), consequentemente, peixes predadores do topo de cadeia representam ligações importantes entre a contaminação por mercúrio e a saúde humana (ASCHNER 2002). O metilmercúrio afeta principalmente: mucosa intestinal, sangue, rins, músculo, tecido nervoso e fígado (MELA et al., 2010). Diante do exposto, o trabalho apresenta resultados do estudo de caracterização de metaloproteínas ligadas ao Hg em amostras de tecido hepático de peixes jaraqui (Semaprochilodus sp.)coletados no entorno da AHE- Jirau - Ro.

Material e métodos

Material e Métodos Os fígados de peixes coletados foram macerados com N2, as proteínas obtidas foram fracionadas através misturas etanol/clorofórmio e etanol/ ácido clorídrico. O precipitado foi lavado com etanol gelado e a determinação da proteína total foi realizada através do método de Biureto. Após esses procedimentos, os pellets proteicos foram ressolubilizados em tampão específico e submetidos ao processo de separação por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D –PAGE), (gel de 15%). Os spots de massa molar inferior a 20 kDa foram recortados e passados por processo de digestão ácida e o Hg quantificado através de técnica de espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS). Os spots que apresentaram Hg, foram levados para caracterização das proteínas por espectrometria de massa (ESI-MS) com objetivo de identificar possíveis biomarcadores proteicos de mercúrio.

Resultado e discussão

Resultados e Discussão Foram caracterizadas por espectrometria de massas, sete spots do tecido hepático do peixe jaraqui (Semaprochilodus sp.), sendo caracterizadas nesses, 5 proteínas/enzimas que podem ser consideradas como candidatas a biomarcadores de Hg (Tabela 1). Entre as mais promissoras estão: Parvalbumin e suas isoformas (parvalbumin- 2 e parvalbumin beta), proteína de baixa massa molar (11-12 kDa) que normalmente se ligam à íons de cálcio e está diretamente envolvida em processos de relaxamento muscular. Sua estrutura é basicamente formada por sequências peptídicas que contém serina e alanina – aminoácidos que apresentam estruturas com grupos carboxílicos, amino e hidroxila, suscetíveis à complexação de íons metálicos divalentes, principalmente cálcio e magnésio (BERBEL et al., 1996). No entanto, por essa proteína apresentar sítios de ligações de metais divalentes disponíveis, podem formar ligações com íons Hg2+ (GARCIA et al., 2006); Ubiquitin -40S ribosomal protein S27a, proteína envolvida na reparação do DNA, regulação do ciclo celular, endocitose e degradação lisossomal. Essa proteína apresenta domínios com grupos específicos para ligação de zinco (zinc- finger metal binding domains) (CHEVALIER et al., 1996) que apresentam características semelhantes ao mercúrio (GARCIA et al., 2006); 39S Ribosomal protein L36 mitochondrial, trata-se de uma proteína componente da subunidade do ribossomo mitocondrial que participa ativamente na síntese de outras proteínas no interior da mitocôndria. Sua sequência peptídica apresenta cadeias terminais com átomos de nitrogênio que podem formar ligações não específicas com íons metálicos divalentes, como o mercúrio, formando uma proteína do tipo metal- binding (GARCIA et al., 2006).

Proteínas identificadas utilizando ESI MS/MS nas amostras de tecido hepático de Jaraqui.

Conclusões

Conclusões As proteínas Parvalbumin, Ubiquitin - 40S ribosomal protein S27a, e 39S Ribosomal protein L36 mitochondrial, encontradas nos spots proteicos de jaraqui possuem grandes possibilidades de serem candidatas a biomarcadoras de mercúrio em peixes. Elas apresentaram intensidade significativa nos géis, reforçando ainda mais a possibilidade do uso dessas proteínas como possíveis biomarcadoras de mercúrio em peixes da região amazonica

Agradecimentos

Agradecimentos: Agradeço a FAPESP-2012/24035-5, ESBR PD-6631-0001/2012 e CAPES pelo apoio financeiro para desenvolvimento desse trabalho.

Referências

Referências Bibliográficas
ASCHNER, M. The neuro-toxic mechanisms of fish-borne methylmercury. Environ. Toxicol. Pharmacol., v. 2, p. 101-104, 2002.
BERBEL, P.; MARCO, P.; CEREZO, J. R.; FELIPE, J. Distribution of parvalbumin immunoreactivity in the neocortex of hypothyroid adult rats. Neuroscience Letters, v. 204, p. 65-68, 2006.
GARCIA, J. S.; MAGALHÃES, C. S.; ARRUDA, M. A. Z. Trends in metal-binding and metalloprotein analysis. Talanta, n. 69, p. 1-15, 2006.
JESUS, T. B.; CARVALHO, C. E. V. Utilização de biomarcadores em peixes como ferramenta para avaliação de contaminação ambiental por mercúrio (Hg). Oecol. Bras., v. 12, p. 680-693, 2008.
MELA, M.; CAMBIER, S.; MESMER-DUDONS, N.; LEGEAY, A.; GRÖTZNER, S. R.; OLIVEIRA RIBEIRO, C. A. Location methylmercury in Danio rerio retina after trophic and subchronic exposure: the basis for neurotoxicology. Neurotoxicology, v. 31, p. 448-453, 2010.
MELA, M.; NETO, F. F.; YAMAMOTO, F. Y.; ALMEIDA, R.; GRÖTZNER, S. R.;VENTURA, D. F.; RIBEIRO, C. A. O. Distribution of mercury in target organs and biochemical responses after trophic and subchronic exposure of Neotropical fish Hoplias malabaricus. Springer Sci.,v. 13, p. 250-262, 2013.
QIU, G.; FENG, X.; WANG, S.; FU, X.; SHANG, L. Mercury distribution and speciation in water and abandoned fish Wanshan Hg mine in Guizhou Province, China. Sci. Total Environ., v. 407, p. 5162-5168, 1996.
SCUDDER, B. C.; CHASER, L. C.; WENTZ, D. A.; BAUCH, N. J.; BRIGHAM, M. E; MORAN, P. W. Mercury in fish, bed sediment, and water streams in the United States. Reston, v. 74, p. 1998-2005, 2009.