Oxidação eletroquímica do DNA e de suas bases nitrogenadas

ISBN 978-85-85905-10-1

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Silva Bruzaca, E.E. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO) ; Campelo Lopes, I. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO) ; Atsushi Tanaka, A. (UFMA)

Resumo

A estrutura do DNA é formada por grupos fosfato, pentoses e bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina e timina. A estrutura formada por um grupo açúcar e uma base nitrogenada é denominada nucleosídeo. O DNA é o principal alvo da célula que pode ser danificado através da oxidação das suas bases nitrogenadas. Diante disso, objetivou-se estudar o comportamento eletroquímico destas bases, dos nucleosídeos guanosina e adenosina e do dsDNA (cadeia dupla) e ssDNA (cadeia simples) em solução aquosa, sobre eletrodo de carbono vítreo, utilizando voltametria de pulso diferencial e voltametria de onda quadrada. De acordo com os resultados obtidos verificou-se que todas as bases e nucleosídeos, bem como o dsDNA e ssDNA sofrem oxidação eletroquímica sobre a superfície do eletrodo.

Palavras chaves

DNA; bases nitrogenadas; oxidação

Introdução

O DNA é uma macromolécula biológica responsável pelo armazenamento e transmissão da informação genética. É um polímero linear constituído por unidades monoméricas denominadas nucleotídeos (SAENGER, p. 62, 1984). Um nucleotídeo é formado por três estruturas moleculares: um grupo fosfato, um grupo açúcar e uma base nitrogenada. A estrutura formada por um grupo açúcar e uma base nitrogenada é denominada nucleosídeo, por exemplo, guanosina (dG) e adenosina (dA). O DNA é o principal alvo da célula que pode ser danificado por vários fatores como a radiação ionizante ou diferentes tipos de compostos (DICULESCU, p. 6, 2004). Os principais tipos de danos ao DNA incluem interrupções no esqueleto açúcar-fosfato, liberação de bases devido à hidrólise de ligações N-glicosil e uma variedade de lesões nas bases, resultantes de reações de DNA com uma ampla variedade de oxidantes, agentes alquilantes, etc (LOPES, p. 21, 2011). Os pares de bases nitrogenadas adenina (A)-timina (T) e guanina (G)-citosina (C) codificam a informação genética celular. E através da sua sequência e emparelhamento carregam toda a informação genética, enquanto o açúcar e o fosfato constituem apenas a espinha dorsal estrutural do DNA (BRETT e SERRANO, p. 97, 1995). A modificação química de cada uma das bases do DNA causa danos ao material genético,como perturbação molecular que conduz a um mau funcionamento e morte celular. A G é de todas as bases a mais facilmente oxidável, sendo por isso o alvo principal dos danos causados por oxidação ao DNA dentro da célula (HALLIWELL e GUTTERIDGE, p. 30, 1999). Diante disso, uma investigação dos processos oxidativos in situ do DNA e de suas bases nitrogenadas, por meio de técnicas voltamétricas fornece uma visão in vivo do que ocorre a nível celular.

Material e métodos

A, G, T, C, dG, dA, dsDNA e ssDNA foram obtidas da Sigma.Soluções estoque de A, G, dG e dA 500 µmol L-1, T e C 1000 µmol L-1 foram preparadas com água purificada e mantidas à 25 ºC. Para completa dissolução da G foi preparada uma solução 9,0 mol L-1 de NaOH, sendo adicionados 25 µL à solução estoque dessa base. Soluções padrão de dsDNA e ssDNA 600 µg mL-1 foram preparadas pela dissolução dos mesmos em água purificada. As soluções foram mantidas a 4 ºC por 24 h. Em seguida, foi determinada a concentração real dessas soluções por espectrofotometria UV-Vis, através da multiplicação da absorbância encontrada experimentalmente pelo fator de conversão (1u A260nm = 50 μg mL-1 de dsDNA ou ssDNA) (FASMAN, p. 589,1975). A solução tampão acetato pH 4,5 foi utilizada em todos os experimentos. Os ensaios voltamétricos foram realizados em um potenciostato Autolab PGSTART 302N, controlado por um computador e interfaciado com software GPES versão 4.9. Os estudos foram efetuados em uma cela eletroquímica de compartimento único com capacidade de 10 mL, composta por um eletrodo de trabalho (eletrodo de carbono vítreo, ECV, Ø = 3 mm), um eletrodo de referência de Ag/AgCl e um eletrodo auxiliar de fio de Pt. Antes de cada medição, a superfície do eletrodo foi polida com spray de grão de diamante (tamanho da partícula = 1 μm) da Kemet International Ltd, UK, e em seguida, lavada rigorosamente com água purificada. As técnicas voltamétricas utilizadas foram voltametria VPD e VOQ. Os parâmetros experimentais para as medidas eletroquímicas foram: amplitude de pulso (ΔEp) de 50 mV, largura de pulso (ΔEt) de 70 ms e velocidade de varredura (v) de 5 mV s-1 para VPD; e frequência de pulso (f) de 50 Hz, incremento de potencial (ΔEs) de 2 mV e amplitude de pulso (ΔEp) de 50 mV para VOQ.

Resultado e discussão

A oxidação eletroquímica das bases, nucleosídeos e DNA sobre ECV em solução tampão acetato pH 4,5 foi investigada por VPD e VOQ. Os voltamogramas registrados paras as bases e nucleosídeos mostraram os seguintes potenciais de pico de oxidação: Ep = + 0,96 V (G), Ep = + 1,25 V (A), Ep = + 1,36 V (T), Ep = + 1,52 V (C), Ep = + 1,17 V (dG) e Ep = + 1,46 V (dA). A oxidação eletroquímica da G, A, T, C, dG e dA foi também investigada por VOQ. Todos os voltamogramas registrados apresentaram as correntes: It – corrente total, If – corrente direta e Ib - corrente inversa. A irreversibilidade do processo redox para cada base e nucleosídeo foi observada. Verificou-se que na corrente inversa não houve picos característicos de redução, evidenciando que as bases e nucleosídeos estudados não se reduzem nos potenciais aplicados sobre o ECV. A oxidação eletroquímica do DNA foi investigada por VPD, a partir de uma solução 50 µg mL-1de dsDNA e ssDNA em solução tampão acetato pH 4,5. Os voltamogramas registrados para a solução de dsDNA e ssDNA mostraram a presença de dois picos de oxidação: dG e dA, em Ep = + 0,99 V e Ep = + 1,25 V, respectivamente. Os voltamogramas obtidos para o dsDNA e ssDNA mostraram uma maior dificuldade das bases purínicas (A e G) em se oxidarem no interior da dupla hélice rígida, quando comparado com a oxidação verificada numa hélice simples de um polinucleotídeo, devido à maior exposição dessas na superfície do ECV. O comportamento eletroquímico do dsDNA e ssDNA 50 µg mL-1 foi estudado por VOQ em solução tampão acetato pH 4,5. A irreversibilidade do processo redox para dsDNA e ssDNA nessa solução foi observada.

Conclusões

A investigação eletroquímica das bases, nucleosídeos e DNA, utilizando VPD e VOQ, mostraram que a G, A, T, dG, dA, dsDNA e ssDNA sofreram oxidação sobre ECV, em soluções tampão ácida e neutra.Pela técnica de VOQ observou-se a irreversibilidade do processo redox de cada base, nucleosídeo e DNA. Observou-se que na corrente inversa não houve picos característicos de redução, evidenciando que as bases, nucleosídeos e DNA estudados não se reduzem nos potenciais aplicados sobre o ECV.

Agradecimentos

CNPq, CAPES, FAPEMA, LELQ-UFMA.

Referências

DICULESCU, V. C. Desenvolvimento e aplicações do biossensor electroquímico com DNA. Coimbra, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade de Coimbra, Portugal, 2004. Tese de doutorado, 285p.
FASMAN, G. D. Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 3 ed., CRC Press, Cleveland, OH, 1975, p. 589.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine, 3rd ed., Oxford University Press, 1999, 640p.
LOPES, I. C.Estudo eletroquímico e eletroanalítico da microcistina-LR e avalição in situ da sua interação com DNA. João Pessoa, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal da Paraíba, Brasil, 2011. Tese de doutorado, 148p.
OLIVEIRA BRETT, A.M.; SERRANO, S.H.P. The electrochemical oxidation of DNA. Journal of Brazilian Chemical Society, 6, 97-100, 1995
SAENGER, W. Principles of nucleic acid structure, Springer Advanced Text in Chemistry, ed. C.R. Cantor, Springer-Verlag, New York, 1984, 556p.