Seleção qualitativa de fungos das sementes de andiroba (Carapa guianensis) e das raízes de mandioca (Manihot suculenta) produtores da enzima xilanase.

ISBN 978-85-85905-10-1

Área

Bioquímica e Biotecnologia

Autores

Passos, L.C. (UFPA) ; Lee, M.S.O. (UFPA) ; Souza, M.G.S. (UFPA) ; Santos, A.S. (UFPA)

Resumo

As xilanases são enzimas hidrolíticas que possuem a capacidade de despolimerizar a xilana e é utilizada em grande escala no branquemento do papel e em outros setores industriais. Foi realizado o teste de revelação com o Vermelho congo nas linhagens selecionadas de fungos filamentosos isolados das raízes de mandioca (Carapa guianensis) e das sementes de andiroba (Manihot suculenta). Dos 20 fungos que foram selecionados aleatoriamente, seis deles apresentaram halo de degradação e provavelmente são os que produzem maior atividade xilanásica e apenas um não descorou o halo, ou seja, não produz a enzima. O experimento realizado é qualitativo, mas satisfatório e indispensável para a posterior quantificação desta enzima e investigação da produção por um determinado período em cultivo submerso.

Palavras chaves

atividade enzimática; fungos filamentosos; xilanase

Introdução

As xilanases são enzimas responsáveis principalmente pela hidrólises das ligações β-1,4 que estão presentes em um componente da hemicelulose, a xilana vegetal. Dessa forma, as hemiceluloses possuem vários polímeros que podem ser formados por diferentes resíduos de açúcares e que a degradação completa necessita da cooperação mútua entre esta enzimas. A endo β-1,4 xilanase é a principal enzima de despolimerização da xilana(COUGHLAN & HAZLEWOOD, 1993). Esta enzima forma um grupo de enzimas que são envolvidas na degradação da xilana, ou seja, é uma endo-enzima que hidrolisa ligações do tipo β-1,4 dentro da cadeia principal da xilana, a hemicelulose, liberando assim os xilo-oligossacarÌdeos As enzimas endo-1,4-ß-xilanase possuem grande aplicação no setor industrial: na produção de alimentos como sucos, vinhos, cervejas e pães, no branqueamento de polpas de papel, na fabricação de materiais têxteis e até na produção de etanol. Os fungos filamentosos possuem a capacidade de produzir tais enzimas, pois estes tem a capacidade de degradar um material hemicelulolítico de maneira extracelular, de forma que esses materiais possam ser despolimerizados e transformados em compostos menores. As xilanases produzidas por fungos podem ser classificadas em constitutivas e/ou indutivas. Geralmente os fungos filamentosos são mais indutivos, ou seja, aumentam sua produção de enzimas de acordo ao fornecimento de determinado substrato e também sendo melhorada se o pH, temperatura, composição do substrato forem mantidos em condições ótimas para a produção. O trabalho teve o objetivo de selecionar, inicialmente de maneira qualitativa, linhagens de fungos filamentosos das sementes andiroba(Carapa guianensis)e das raízes de mandioca(Manihot suculenta) que sejam produtores da enzima xilanase.

Material e métodos

Foram selecionadas 20 linhagens de fungos filamentosos, sendo que 12 destes foram isolados das raízes de mandioca(Manihot suculenta)e o restante isolado das sementes de andiroba(Carapa guianensis). Estes fungos encontram-se na micoteca do LabISisBio-UFPA preservados em água, glicerol e óleo mineral. Os fungos selecionados de forma aleatória foram inoculados em placas de BDA (meio de cultura Dfco pronto: 39g de BDA para 1000mL de água desionizada). Após 10 dias, os mesmos foram inoculados em placas de XPY (1% de xilano, 0,25% de extrato de levedura, 0,25% de peptona e 2% agar) para adaptação dos microorganismos ao meio de cultura e de produção da enzima xilanase. As placas de XPY inoculadas foram incubadas em estufa a 30°C até que os mesmos apresentassem um eixo de crescimento entre 2,5 e 4cm na placa. A maioria desse dos fungos selecionados apresentou este crescimento entre 48 e 96 horas. Após os fungos apresentarem o crescimento descrito acima, estes foram submetidos ao teste de revelação com o vermelho congo e cloreto de sódio. Este teste de revelação mostra se o fungo produz a enzima xilanase e isso pode ser comprovado pela a descoloração do meio e formação de halo de degradação. As placas XPY foram retiradas da estufa após o crescimento das colonias onde foi adicionado as mesmas cerca de 15mL de solução de 0,1% de Vermelho congo até que toda a colônia mantivesse-se coberta pela solução. Após duas horas, foi retirada esta solução e adicionado 15mL de solução 1M de NaCl novamente sobre colônia durante um período de 30 minutos. Após os 30 minutos, foi retirada a solução salina e observado quais colônias apresentaram uma descoloração e um halo de degradação. Foram feitos os registros das colonias produtoras da enzima por meio de fotos e a medida do halo produzido.

Resultado e discussão

O teste de revelação utilizando o Vermelho congo e Cloreto de sódio é um teste qualitativo e tem o objetivo de selecionar os microorganismos produtores da enzima xilanase através da percepção da descoloração da colônia e a formação de um halo ao redor da mesma no final do teste. As tabelas e figuras 1 e 2 abaixo mostram os fungos que foram positivos neste teste. Segundo a literatura, os microorganismos que formarem um halo ao redor da colônia são os que provavelmente apresentam uma maior produção da enzima, ou seja, quanto maior o halo de degradação maior atividade a produção de atividade xilanásica. De acordo com as tabelas 1 e 2, os fungos com o código MIBA 0021, 0130 e 0288 isolados das sementes de andiroba e os fungos com o código MEφ C-7A, 8II, C27AII isolados das raízes de mandioca são os que apresentaram maior halo de degradação, ou apresentaram halo, e provavelmente são os fungos que possuem maior produção da enzima. Esses halos variaram entre 0,1 e 0,5cm e o fungo MIBA 0288 foi o que apresentou o maior halo. Foi observado que a maioria dos fungos isolados da andiroba não foram capazes de produzir a enzima em grande quantidade, pois não apresentaram halo de degradação. Já em relação aos fungos isolados das raízes de mandioca, apenas o fungo C-25P não descorou a colônia (mostrou-se negativo para a produção da enzima). As figuras 1 e 2 mostram de forma qualitativa como cada fungo se comportou ao final do teste de revelação. É importante ressaltar que os fungos que apenas descoraram a colônia e não formaram halo também produzem a enzima, mas provavelmente produzem em menor quantidade.

A figura 1 mostra a descoloração das colônias dos fungos isolados das sementes de andiroba após o teste de revelação com Vermelho congo 0,1% e NaCl 1M


A figura 2 mostra a descoloração das colônias dos fungos isolados das raízes de mandioca após o teste de revelação com Vermelho congo 0,1% e NaCl 1M.


A tabela 1 refere-se ao tamanho do halo produzido (cm) ao redor da respectiva colônia de fungos isolados das sementes de mandioca (Carapa guianensis).


A tabela 2 refere-se ao tamanho do halo produzido (cm) ao redor da respectiva colônia de fungos isolados das raízes de mandioca (Manihot suculenta)

Conclusões

O teste de revelação para atividade xilanásica foi satisfatório, pois a partir dele foi possível observar que a maioria dos fungos selecionados produzem a enzima. Os fungos com códigos MIBA 0021, 0130, 0288, MEφ C-7A, 8II, C27AII foram os que apresentaram maior halo de degradação e por isso foram considerados os melhores para a produção xilanásica. Em complementação ao trabalho, posteriormente será feita o cultivo submerso desses fungos selecionados para quantificar a produção dessa atividade xilanásica, da produção de glicose e proteína por esses microorganismos.

Agradecimentos

Agradeço ao LabISisBio-UFPA pela ajuda na realização do projeto, ao Pibic/UFPA e ao CNPq pela bolsa concedida.

Referências

COUGHLAN, M. P. AND HAZLEWOOD G. β-1,4-D-Xylan-degrading enzyme systems: Biochemistry, molecular biology and applications. Biotechnol. Appl. Biochem. 17, 259-289, 1993.
MACIEL, G.M. Desenvolvimento de Bioprocessopara a produção de xilanases por fermentação no estado sólido utilizando o bagaço da cana de açúcar e farelo de soja. Dissertação de mestrado. Universidade Federal do Paraná, 2006.
SANTOS, L.F.; ISHII, P, L.Xilanases: Principais Metodologias e Parametros Cinéticos. Journal of Biotechnology and Biodiversity. Vol. 2, N. 2: pp7-15, 2011
THEATHER and WOOD. Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen. Applied and Environmental Microbiology 4 p. 777-780, 1982.