ISBN 978-85-85905-10-1
Área
Bioquímica e Biotecnologia
Autores
Vieira Neto, A.E. (UFC) ; Monteiro Moreira, A.C.O. (UNIFOR) ; Moreno, F.B.M.B. (UNIFOR) ; Moreira, R.A. (UNIFOR)
Resumo
A Frutalina é uma lectina com afinidade a α-D-galactose e tem sido usada para a detecção de neoplasias. O trabalho visa isolar suas isoformas e estabelecer o estágio de maturação em que cada uma foi produzida. A lectina foi obtida por cromatografia de afinidade, em coluna de D-galactose e sua pureza foi avaliada por SDS-PAGE. Em seguida, foi submetida à cromatografia de troca-iônica e à eletroforese 2D. Os spots do gel 2D e os picos obtidos por troca-iônica foram digeridos com tripsina e identificados por ESI-MS. Os resultados sugerem que os picos contendo isoformas têm identidade com os spots do gel 2D e com os clones de Frutalina previamente conhecidos, promovendo a possibilidade de estudos sobre a possível diferenciação das afinidades a carboidratos, de cada isoforma.
Palavras chaves
frutalina; isoformas; isolamento
Introdução
A lectina utilizada no projeto é uma das encontradas na semente de Artocarpus incisa L. (Frutalina), conhecida popularmente como fruta-pão. A Frutalina é uma lectina ligante de α-D-galactose e tem sido usada para a detecção de neoplasia tireoidiana, prostática e da mama, e pode desempenhar um papel importante como ferramenta biotecnológica em estudos de histoquímica e citoquímica. Em trabalhos anteriores, foi realizada a clonagem do gene da frutalina a partir de RT-PCR de sementes de A. incisa em fases distintas de desenvolvimento, tendo sido obtidos dez clones. O objetivo do trabalho é determinar as diferenças entre as isoformas, seja na sua composição aminoacídica, modificações pós-traducionais, e até mesmo na sua estrutura tridimensional, estabelecendo em que estágio de maturação cada uma foi produzida, e com isso, ser capaz de entender as reais necessidades da planta em expressar cada isoforma em cada estágio.
Material e métodos
As sementes foram cedidas pelo Núcleo de Biologia Experimental da Unifor, e foram coletadas de frutos maduros na cidade de Maranguape-CE. A Frutalina foi obtida por cromatografia de afinidade, aplicando 20mL do extrato bruto em coluna de 5mL de agarose-D-galactose e a pureza foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE). A proteína pura foi dialisada contra água ultrapura, liofilizada e submetida a cromatografia de troca-iônica, em uma coluna trocadora aniônica (Mono Q) acoplada a um cromatógrafo líquido de rápida performance (FPLC) e à eletroforese bidimensional. Os picos obtidos por troca-iônica e os spots do gel 2D foram digeridos com trípsina e identificados por ESI-MS.
Resultado e discussão
Com a eletroforese bidimensional, aproximadamente 15 spots foram detectadas, os
quais foram digeridos com tripsina e identificadas por espectrometria de massa,
mostrando identidade com a Jacalina, uma lectina 98% semelhante (MOREIRA et al.,
1998), que já tem sua sequência e sua estrutura bem estabelecidas na literatura
(SANKARANARAYANAN, 2003).
A cromatografia de troca-iônica mostrou-se eficiente no isolamento de 10 frações
contendo isoformas, que foram eluídas com steps de gradiente salino, numa
proporção de 46,5% (FTL-0), 15,8% (FTL-1), 19,6% (FTL-2), 6,8% (FTL-3), 3,1%
(FTL-4), 1,9% (FTL-5), 1,2% (FTL-6), 2,2% (FTL-7), 3,5% (FTL-8) e 2,84% (FTL-9).
Cada fração obtida foi digerida por tripsina e analisada por espectrometria de
massa, demonstrando diferentes níveis de identidade com as sequências
previamente obtidas por RT-PCR (NEPOMUCENO, 2008), o que sugere uma posterior
quantificação de cada isoforma presente em cada pico, para um resultado
quantitativo mais conclusivo.
Conclusões
A presença de isoformas em lectinas aumenta o uso biotecnológico da planta e estes resultados sugerem que as frações contendo isoformas obtidas por cromatografia de troca-iónica podem ser relacionadas com os spots do gel 2D e com os clones de Frutalina previamente conhecidos, permitindo estudos sobre a possível diferenciação na afinidade de reconhecimento a carboidratos, de cada uma das isoformas, em cada fase de maturação.
Agradecimentos
A Deus, ao meu orientador (Prof. Renato Moreira), aos meus co-orientadores (Pepeu e Prof. Ana Cristina) e à minha família.
Referências
MOREIRA, R. A., BRANCO, C. C. C., MONTEIRO, A. C. O., TAVARES, R. O., BELTRAMINI, L. M. Isolation and partial characterization of a lectin from Artocarpus incisa L. seeds. Phytochemistry, 7, 1183-1188, 1998.
NEPOMUCENO, D. R. Clonagem e expressão de uma lectina de Artocarpus incisa L. (Frutalina) em Escherichia coli; UFC – Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, 2008.
SANKARANARAYANAN, R., SEKAR, K., BANERJEE, R., SHARMA, V., SUROLIA, A., VIJAYAN, M. A novel mode of carbohydrate recognition in jacalin, a Moraceae plant lectin with a beta-prism fold. Nat Struct Biol, 3:596-603, 1993.
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