ISBN 978-85-85905-10-1
Área
Bioquímica e Biotecnologia
Autores
Santos, G.S. (UFPE) ; Andrade, C.A.S. (UFPE) ; Balbino, V.Q. (UFPE) ; Oliveira, M.D.L. (UFPE)
Resumo
O presente trabalho possui como objetivo a avaliação do processo de interação do sistema núcleo-casca de magnetita (NpFe3O4) e ouro (Au) para o diagnóstico da esquistossomose. Técnicas eletroquímicas como a espectroscopia de impedância eletroquímica e voltametria cíclica são ferramentas úteis para o desenvolvimento de biossensores. A partir da análise dos resultados foi possível verificar que o nanocompósito manteve a capacidade de estabelecer uma imobilização estável da molécula de DNA específico para a esquistossomose. Portanto, verifica-se o potencial de aplicabilidade do biossistema para o desenvolvimento de sensores eletroquímicos para detecção da esquistossomose.
Palavras chaves
Genossensor; Schistosoma; Impedância Eletroquímica
Introdução
A esquistossomose mansoni (EM) é uma parasitose causada pelo Schistosoma mansoni, sendo de grande importância no contexto da saúde pública (SOUSA et al., 2011). Sua confirmação diagnóstica é tomada principalmente pela análise de amostras fecais (PALMEIRA et al., 2010). Testes diagnósticos, como ELISA, imunoensaio de fluorescência indireta e radioimunoensaio são também utilizados. Mas, geralmente necessitam de longos períodos para a análise e apresentam baixa sensibilidade (WU et al., 2006). Desta forma, há a necessidade do desenvolvimento de métodos sensíveis, rápidos e seletivos para a detecção do Schistosoma (XU et al., 2011). Genossensores são promissoras ferramentas diagnósticas devido ao seu potencial para a detecção rápida de sequências de DNA,(ELIE, 2005). As propriedades das nanopartículas de núcleo/casca têm atraído muita atenção em particular as magnéticas como a magnetita (NpFe3O4) com casca de ouro (Au) que possuem estabilidade química, além de melhorar a sua biocompatibilidade e também as propriedades ópticas, magnéticas e catalíticas da superfície do eletrodo (WU, 2008). As NP de ouro têm a capacidade de estabelecer uma imobilização estável de biomoléculas, sendo, uma grande vantagem para a preparação de biossensores. Portanto, iremos sintetizar NP formadas por um núcleo de óxido de ferro com uma casca de ouro (NpFe3O4/Au) com a superfície modificada com oligonucleotídeos para o reconhecimento do genoma de esquistossomose. Houve modificação da superfície do eletrodo de ouro com o ácido mercaptobenzóico (AMB). Posteriormente, conjugou-se N-hidroxisuccinimida(NHS) e (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) (EDC) com a subsequente adição de NpFe3O4/Au, para aumentar a superfície de contato do eletrodo.Finalmente, foi quimicamente ligada a sonda modifica
Material e métodos
Os experimentos de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) e Voltametria Cíclica (VC) foram realizados em uma célula convencional de três eletrodos. O eletrodo de trabalho utilizado foi o de ouro, o de platina como contra eletrodo e o de referência foi o Ag/AgCl saturado com KCl. Foi utilizada uma solução de 10mM de ferro-ferricianeto de potássio como par redox. As análises voltamétricas foram analisadas a um potencial de -0,2 a 0,7 V. Os espectros de impedância foram registrados na faixa de frequências de 100 mHz a 100kHz. As nanopartículas de núcleo/casca de NPsFe3O4/Au foram sintetizadas de acordo com Gam (2011). A modificação da superfície do eletrodo teve a seguinte sequencia: adição de 2µL de AMB por 15s, em seguida gotejou-se 2µL da solução de EDC:NHS por 10min, logo após adicionou-se 2µL do NPsFe3O4/Au por 10 min. Posteriormente, incubou-se a sondaschistosoma por 20 min e por fim o sistema sensor foi exposto a diferentes concentrações do DNA genômico. As análises de adsorção ao eletrodo foram realizadas após cada etapa de modificação da superfície
Resultado e discussão
Nas análises de EIE foram observados o aumento do semicírculo de Cole-Cole
devido ao processo de modificação do eletrodo. Inicialmente, o diagrama de
Nyquist para o eletrodo de ouro refletiu um comportamento limitado por difusão.
Após a adição progressiva das camadas na superfície do eletrodo, observou-se um
aumento gradual da resistência à passagem da corrente elétrica (Re), evidenciado
pelo aumento no diâmetro do semicírculo do diagrama de Nyquist (Figura 1).
Pode-se observar que após a interação do sistema AMB-NPsFe3O4/Au-Sonda com o
genoma de Schistosoma, houve um incremento na Re, estando associado ao processo
de bioreconhecimento do sistema via hibridação. Na análise dos voltamogramas
cíclicos foi observado que após a modificação gradativa do eletrodo houve uma
diminuição na resposta voltamétrica do sistema, resultando numa diminuição dos
picos catódicos e anódicos da sonda redox (Figura 2). Em adição, após o processo
de hibridação a curva voltamétrica demonstrou um comportamento sigmoidal
característico de processo quase-reversível. Os resultados obtidos comprovam a
interação do sistema NPsFe3O4/Au-sondaschistosoma com o genoma.
Análise Impedimétrica para diferentes concentrações do genoma.
Análise voltamétrica para diferentes concentrações do genoma
Conclusões
A plataforma sensora obtida mostrou-se eficiente na detecção do genoma do Schistosoma e sua sensibilidade pôde ser observada através da análise de diferentes concentrações do DNA, confirmando que o genossensor desenvolvido mostra-se como uma ferramenta importante para a construção de um método diagnóstico mais sensível, rápido e com baixo custo.
Agradecimentos
Rede Nanobio/Capes, CNPq, FACEPE.
Referências
ELIE, G.A.; LINGERFELT, L. 2005. Top. Curr. chem.260. 161-186
GAN,N., JIN, H., LI, T., ZHENG, L. Fe3O4/Au magnetic nanoparticle amplification strategies for ultrasensitive electrochemical immunoassay of alfa-fetoprotein. Int J Nanomedicine. 2011; 6: 3259–3269.
PALMEIRA, D.C.C.; CARVALHO, A.G.; RODRIGUES, K.; COUTO, J.L.A. 2010. Prevalência da infecção pelo Schistosoma mansoni em dois municípios do Estado de Alagoas. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 43(3):313-317.
SOUZA, F.P.C.; VITORINO, R.R.; COSTA, A.P. 2011. Esquistossomose mansônica: aspectos gerais, imunologia, patogênese e história natural. Rev Bras Clin Med;9(4):300-7.
WU, W.; HE, Q.; JIANG, C. 2008. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surfacefunctionalization strategies, Nanoscale Res. Lett. 3 397–415.
XU, Z.; HU, C.; HU, G. 2011. Layer-by-layer self-assembly of multilayer films based onhumic acid, Thin Solid Films 519, 4324–4328.
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