ISBN 978-85-85905-10-1
Área
Bioquímica e Biotecnologia
Autores
Garcia, M.F.K.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Andrade, C.A.S. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Balbino, V.Q. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO) ; Oliveira, M.D.L. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO)
Resumo
O trabalho tem como principal objetivo estudar o processo de adsorção de primer de Leishmania chagasi sobre a superfície do nanocompósito de ouro de polianilina (NcAuPANi) para a detecção do genoma de L. chagasi isolado de cães infectados. A avaliação do sistema foi realizada através das técnicas eletroquímicas de voltametria cíclica (VC) e espectroscopia de impedância (EI) para caracterizar as propriedades elétricas do sistema NcAuPANi-primerL.chagasi. Os resultados demonstraram que o sistema NcAuPANi-primerL.chagasi interagiu com o genoma do L. chagasi em diferentes concentrações sendo observada uma diminuição da resposta amperométrica total do sistema e aumento da resistência de transferência de carga. Portanto, o sistema NcAuPANi-primerL.chagasi é uma alternativa para a biodiagnóstico.
Palavras chaves
voltametria; impedância; biossensor
Introdução
A Leishmania é um gênero de protozoários da família Trypanosomatidae. A leishmaniose é transmitida ao homem por insetos vetores ou transmissores, conhecidos como flebotomíneos. A transmissão acontece quando uma fêmea infectada passa o protozoário a uma vítima sem a infecção, enquanto se alimenta de seu sangue (IOC/FIOCRUZ, 2013). São reconhecidas três espécies como agentes etiológicos da doença destacando-se a Leishmania chagasi (REIS et al.; 2006). Atualmente o número de cães infectados constitui um problema na transmissão da infecção para humanos (ALVES e BELIVALCQUA, 2004). Aspectos clínicos para o diagnóstico são de extrema importância devido à presença de sinais e sintomas inespecíficos em oligosintomáticos (TEIXEIRA-NETO et al., 2012). A modificação da superfície do eletrodo, com nanopartículas metálicas tem levado ao desenvolvimento de vários sensores eletroquímicos. Em particular, as nanopartículas de ouro, têm sido intensamente investigadas para o desenvolvimento de eletrodos biossensíveis. (YU et al., 1997). Atualmente, nanocompósitos de ouro e polianilina (NcAuPANi) demonstram propriedades elétricas e ópticas diferenciadas (ANDRADE et al., 2008) que os tornam elementos essenciais para o desenvolvimento de sistemas biossensíveis (NASCIMENTO et al., 2011). O uso de NcAuPANi advém da possibilidade do uso deste sistema para imobilização de ácidos nucléicos na superfície do eletrodo. Desta forma, o NcAuPANi demonstra ser um bom candidato como matriz para o desenvolvimento de um biossensor de L. chagasi. O presente estudo possui como objetivo realizar uma avaliação voltamétrica e impedimétrica da adsorção do primer LITSR para o desenvolvimento de um biossensor para o genoma de pacientes contaminados com Leishmania chagasi.
Material e métodos
O eletrodo de ouro foi polido com alumina 0,5um e sonicado por 1 minuto em água deionizada, e posteriormente seco com nitrogênio (N2). Em seguida, o eletrodo de ouro foi submetido a um potencial de -0,2 V para torná-lo catódico por 2 min. Posteriormente, o eletrodo foi imerso no sistema NcAuPANI-PRIMERLeishmania por 10min, em seguida será removido e seco. Após obtenção do eletrodo modificado com NcAuPANi-PRIMERLeishmania, este sistema foi submetido a incubação com o genoma de pacientes contaminados com genoma de L. chagasi diluídos em tampão fosfato de sódio pH 7,4. Os experimentos de VC e espectroscopia de Impedância EIE serão realizados em um Potenciostato/galvanostato Autolab PGSTAT128N numa célula convencional de três eletrodos. O eletrodo de trabalho (ET) utilizado foi o de ouro modificado com o primer, um eletrodo de ouro como contra eletrodo e o de referência foi o Ag/AgCl saturado com KCl. As medidas de VC foram realizadas na mesma solução de ferro-ferricianeto de potássio com potenciais de -0,2 a 0,7V e velocidade de varredura de 50 mV. As medidas de impedância eletroquímica (EIE) foram realizadas numa faixa de frequência entre 100 mHz a 100 KHz com um potencial de amplitude alternada de 10 mV . (OLIVEIRA et al., 2008).
Resultado e discussão
Na Fig. 1a demonstra as análises de VC das etapas de montagem do biossensor. A
análise do eletrodo de ouro limpo (Au) revela um voltamograma de um processo
limitado por difusão, com uma boa separação das correntes de pico anódica (ipa)
e catódica (ipc) referente ao par redox ferro/ferricianeto de potássio Fig.1a.
Após a adsorção do compósito AuNpPANi sobre a superfície do eletrodo Au, houve
uma queda da resposta amperométrica do sistema, o que reflete uma diminuição das
ipa e ipc do sistema. Em adição, a Fig. 1a mostra que após a interação do
PRIMERLeishmania(LITSR) com o sistema AuNpPANi houve uma nova diminuição da
resposta amperometric. Este processo, advém da interação eletrostática entre os
grupos fosfatos carregados negativamente da sonda com os grupos carregados
positivamente do nanocompósito. A Fig. 1b através do diagrama de Nyquist,
podemos observar as etapas de montagem do sistema, porém através de uma técnica
com alta sensibilidade, onde visualizamos a diferença entre cada camada, através
do aumento a resistência da transferência de cargas. Na Fig 2a podemos avaliar a
viabilidade do eletrodo modificado, para detecção do genoma de Leishmania.
Observa-se através do voltamograma que foram testados o genoma concentrado e
suas respectivas diluições. Além disso, verifica-se que com o genoma concentrado
houve uma queda mais pronunciada da resposta eletroquímica em relação ao genoma
diluído. Este processo está relacionado à quantidade de moléculas disponíveis
para a biointeração, onde quanto maior a concentração maior a probabilidade de
interação. Na Fig 2b podemos analisar através do diagrama o resultado do sistema
frente ao genoma de Leishmania e suas diluições, demonstrando a relação linear
entre a resistência de transferência de carga e a concentração do analito.
1 (a) Voltamograma Cíclico das etapas de modificação do eletrodo de trabalho 1 (b) Diagrama de Nyquist com as etapas de modificação do eletrodo.
2(a)Voltamograma cíclico da adsorção do genomas nas diferentes concentrações 2(b)Diagrama de Nyquist adsorção nas diferentes concentrações
Conclusões
Através dos resultados que foram obtidos pode-se concluir que o sistema NcAuPANi- primerL.chagasi é uma alternativa viável para a biodetecção de leishmaniose.
Agradecimentos
CAPES, FACEPE, CNPq e Rede Nanobiotecnologia-CAPES.
Referências
Vilela, M.; Mendonça, S.; Instituto Oswaldo Cruz (IOC/Fiocruz), 2013.
Reis, A.B., Martins-Filho, O.A., Teixeira- Carvalho, Carvalho, M. G., Mayrink, W., França-Silva, J.C., Giunchetti, R.C., Genaro, O., Correa- Oliveira, R. Res. Vet. Sci. 81, 68,2006.
Alves, W. A., Bevilacqua, P. D. Cadernos de Saúde Pública 20, 259, 2004.
Teixeira-Neto, R.G., Giunchetti, R.C., Carneiro, C.M., Vitor, R.W., Coura-Vital, W., Quaresma, P.F., Ker, H.G., De Melo, L.A., Gontijo, C.M., Reis, A.B. Vet. Paras., 11, 248, 2012.
Yu, YY., Chang, S.S., Lee, C.L., Wang, C.R.C. J. Phys. Chem. B, 101, 6661, 1997.
Andrade, C.A.S., Santos, C.G., de Melo, C.P. Compósitos de nanopartículas fluorescentes em si, processo para preparação dos mesmos e uso em sistemas de diagnóstico rápido com afinidade a moléculas biológicas. Nº 00184.2008.
Nascimento, H.P.O., Oliveira, M.D.L., De Melo, C.P., Silva, G.J.L., Cordeiro, M.T., Andrade, C.A.S. Coll. Surf. B, Biointerfaces, 86, 414, 2011.
Oliveira, M.D.L. Correia, M.T.S., Diniz, F.B. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2008, 66, 13.
Patrocinadores
Apoio
Realização
