Realizado no Rio de Janeiro/RJ, de 14 a 18 de Outubro de 2013.
ISBN: 978-85-85905-06-4
ÁREA: Produtos Naturais
TÍTULO: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA E CITOTÓXICA DE DERIVADOS ALQUÍLICOS DO ÁCIDO NORSTÍTICO
AUTORES: Máximo Corrêa de Alcântara, I. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO MATO GROSSO DO SUL) ; Kika Honda, N. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO MATO GROSSO DO SUL) ; Fabrício Gardini Brandão, L. (ESTÁCIO DE SÁ)
RESUMO: Modificações estruturais em produtos naturais são empregadas visando potencializar a atividade de uma dada substância além de favorecer a solubilidade em meio biológico. O ácido norstítico (AN), isolado do líquen Ramalina anceps Nyl. foi tratado com os álcoois (n-propanol, n-butanol, n-pentanol e n-hexanol), sob refluxo. Os derivados 8'–O–n–alquila do AN, após purificação, foram avaliados quanto à toxicidade sobre larvas de A. salina e a ação sobre a enzima tirosinase. O ácido 8'–O–n–hexil-norstítico apresentou potente atividade sobre A. salina, enquanto que os ácidos 8'–O–n–butil-norstítico e 8'–O–n–pentil-norstítico apresentaram potencial atividade sobre a enzima tirosinase.
PALAVRAS CHAVES: Liquens; Modificação estrutural; Ensaios biológicos
INTRODUÇÃO: Liquens são associações simbióticas entre um fungo (micobionte) e uma ou mais algas (fotobionte). São encontrados nos mais variados habitats, estando distribuídos do ártico às regiões tropicais, das planícies às montanhas mais altas (MÜLLER, 2001). Os liquens produzem substâncias fenólicas exclusivas das classes dos depsideos, depsidonas, dibenzofuranos, antraquinonas, xantonas, entre outras (MÜLLER, 2001; OKSANEN, 2006). Muitas dessas substâncias apresentam atividades biológicas, incluindo atividade antitumoral, antioxidante, antimicobacteriana, antibiótica, citotóxica e de inibição da atividade de diversas enzimas (BOUSTIE, 2005), dentre elas, a enzima tirosinase. A enzima tirosinase catalisa a oxidação de fenóis às correspondentes quinonas e é responsável pelo escurecimento enzimático de frutas e vegetais. Essa enzima está envolvida na melanogenese e esclerotização de insetos (MAEDA & FUKUDA, 1991). O ensaio com A. salina é correntemente usado para triagem da toxicidade de compostos ou de extratos. Os resultados deste ensaio têm sido correlacionados à toxicidade contra células tumorais, à semelhança da correlação estabelecida por Solis et al. (1993). Modificações estruturais podem minimizar as propriedades indesejáveis, assim como potencializar a atividade. O ácido norstítico apresenta baixa solubilidade em água e em misturas água/DMSO dificultando a realização de alguns ensaios biológicos. Devido a isso, realizou-se modificações estruturais no ácido norstítico, na tentativa de favorecer a solubilidade e potencializar a atividade. Foram preparados derivados 8'–O–n–alquila do ácido norstítico os quais foram avaliados quanto as atividades de toxicidade sobre larvas de Artemia salina e de inibição da enzima tirosinase.
MATERIAL E MÉTODOS: Talos do líquen Ramalina anceps Nyl. foram triturados e extraídos com acetona, exaustivamente, à temperatura ambiente. Os extratos foram evaporados e o resíduo obtido foi tratado com pequenas porções de clorofórmio e acetona gelados e a mistura centrifugada a 3.000 rpm, até obtenção do ácido norstítico (AN). 100 mg de AN foram tratados com 25 mL de álcool [(n-propanol, n-butanol, n-pentanol e n-hexanol)], sob refluxo. As reações foram monitoradas por CCD. A purificação de cada produto obtido foi conduzida em coluna de Si-gel (230-400 mesh), eluída com misturas de hexano e acetona. As estruturas dos derivados 8'–O–n–alquila do AN foram confirmadas pela análise dos espectros de RMN de 1H, 13C e DEPT-135, obtidos em um aparelho Bruker, modelo DPX300 em DMSO-d6. A toxicidade do AN e dos derivados alquílicos foi avaliada frente a larvas de A. salina. As substâncias dissolvidas em solução salina contendo 3% de DMSO foram distribuídas em tubos de ensaio em concentrações de 600 a 10 μg/mL, em triplicata. A cada tubo foram adicionadas 10 larvas e após 24 horas foram contados o número de indivíduos mortos. Um controle foi preparado nas mesmas condições. Os valores de DL50 foram obtidos no programa PROBITOS. A avaliação da atividade sobre a enzima tirosinase foi realizada pela técnica de bioautografia em CCD. Soluções dos derivados alquílicos foram aplicadas sobre a placa de sílica gel em concentrações de 500 a 50 μg/mL. Após secagem, a placa foi nebulizada com a solução da enzima tirosinase e após cinco minutos com solução de L-DOPA. A atividade inibitória foi indicada pelo aparecimento de manchas brancas em fundo escuro e a reação foi acompanhada durante 40 minutos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: O ácido norstítico isolado de R. anceps foi obtido com rendimento médio de 0,6% (536 mg). Os derivados ácidos 8'–O–n–alquil-norstítico (n-propil, n-butil, n-pentil e n-hexil) foram obtidos com rendimento variando de 40 a 60%. O ácido norstítico apresentou baixa solubilidade em solução salina contendo 3% de DMSO e no ensaio com A. salina foi considerado fracamente ativo (DL50 >500 μg/mL). Os derivados, ácidos 8'–O–n–alquil-norstítico (n-propil, n-butil, n-pentil e n-hexil) apresentaram DL50 de 72, 56, 52 e 32 μg/mL, respectivamente, indicando que a atividade tóxica sobre A. salina aumenta com a elongação da cadeia alquílica. No ensaio de bioautografia os ácidos 8'–O–n–butil-norstítico e 8'–O–n–pentil-norstítico apresentaram potencial atividade sobre a enzima tirosinase em todas as concentrações testadas. Os ácidos 8'–O–n–propil-norstítico e 8'–O–n–hexil-norstítico mostraram menor potencial de inibição da enzima. Esses resultados indicam que a inserção de uma cadeia alquílica no carbono 8' do anel lactol do ácido norstítico resulta em compostos com maior toxicidade frente às larvas de A. salina e com maior potencial de inibição da enzima tirosinase. Os derivados 8'–O–n–alquil do ácido norstítico representam uma nova classe de possíveis inibidores da enzima tirosinase e que poderão ser avaliados como uma alternativa no controle de insetos, como também, para prevenir ou para tratar desordens relacionadas à pigmentação da pele. Além disso, os resultados dos ensaios com A. salina sugerem que esses compostos poderão ser avaliados, também, frente à células tumorais.
CONCLUSÕES: Os resultados obtidos neste trabalho são promissores e mostram que a modificação estrutural do ácido norstítico por inserção de uma cadeia alquílica no C-8' produz compostos mais ativos, quando comparados ao AN. O ácido 8'–O–n–hexil-norstítico apresentou potente atividade citotóxica frente as larvas de A. salina, enquanto o ácido 8'–O–n–propil-norstítico foi o menos ativo. Os ácidos 8'–O–n–butil norstítico e 8'–O–n–pentil-norstítico apresentaram potencial atividade sobre a enzima tirosinase.
AGRADECIMENTOS: À FUNDECT/MS, Sesu/MEC, PET/Instituto de Química-UFMS.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BOUSTIE, J.; GRUBE, M. 2005. Lichens – a promising source of bioactive secondary metabolites. Plant.Gen. Res. 3: 273-287.
MAEDA, K.; FUKUDA, M. 1991. In vitro effectiveness of several whitening cosmetic components in human melanocytes. J. Soc. Cosmet. Chem. 42: 361–368.
MÜLLER, K. 2001. Pharmaceutically relevant metabolites from lichens. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56: 9-16.
OKSANEN, I. 2006. Ecological and biotechnological aspects of lichens. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73: 723-734.
SOLIS, P. N.; WLIGHT, C. W.; ANDERSON, M. M.; GUPTA, M. P.; PHILLIPSON, D. 1993. Planta Med. 59, 250 p.