Realizado no Rio de Janeiro/RJ, de 14 a 18 de Outubro de 2013.
ISBN: 978-85-85905-06-4
ÁREA: Química Analítica
TÍTULO: Comparação entre diferentes técnicas de extração para a determinação de tricotecenos em amostras de trigo
AUTORES: Rosa Seus, E. (FURG) ; Garda Buffon, J. (FURG)
RESUMO: O trigo é um dos cereais mais consumidos no mundo e fatores afetam a sua produção, como a doença causada por fungos do gênero Fusarium. Os tricotecenos são micotoxinas produzidas por espécies de Fusarium. O objetivo deste trabalho foi comparar métodos de extração de tricotecenos em trigo utilizando HPLC-UV. As metodologias testadas foram o método QuEChERS (BEMVENUTI et al.,2012), o método proposto por Tanaka et al. (2000) e as técnicas DLLME (CAMPONE et al.,2011) e MSPD (RUBERT et al.,2011). As amostras foram fortificadas com 1,5ug/mL dos tricotecenos DON, DE-DON, 3-ADON, 15-ADON e NIV. O método QuEChERS apresentou melhor recuperação, com valores que variaram entre 78 a 89%, concluindo-se que este método é promissor para a determinação de tricotecenos em cereais.
PALAVRAS CHAVES: trigo; tricotecenos; metodologia analítica
INTRODUÇÃO: Micotoxinas são metabólitos fúngicos secundários, onde estes compostos compreendem uma grande variedade de estruturas (FONSECA,1996). Os tricotecenos são micotoxinas constituídas por anéis tricotecanos e um grupamento epóxido nas posições 12 e 13 da estrutura, principal responsável por sua toxicidade (LANGSETH,RUNDBERGET,1998). Devido a grande variedade e, muitas vezes, complexidade das estruturas das micotoxinas, tornou-se difícil utilizar uma técnica padrão para análise e detecção destes compostos. Muitos métodos de extração e detecção de micotoxinas já estão sendo aplicados em diversos países do mundo. No pré-tratamento das amostras destacam-se técnicas como extrações líquido-líquido (LLE) e extrações em fase sólida (SPE). Já os métodos de separação que tem ganhado destaque são a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e a cromatografia gasosa (GC) (TURNER,PILETSKY,SUBRAHMANYAM 2009).
Dessa forma, os objetivos deste trabalho foram avaliar e comparar os diferentes métodos de extração: Tanaka, QuEChERS, MSPD (Dispersão da Matriz em Fase Sólida), SLE (Extração Sólido-Líquido) acoplada a DLLME (Microextração Dispersiva Líquido-Líquido) para os tricotecenos deoxinivalenol (DON), deepóxi-deoxinivalenol (DE-DON), 3-acetil-DON (3-ADON), 15-acetil-DON (15-ADON) e nivalenol (NIV) em amostra de trigo. Validar uma metodologia de quantificação das micotoxinas por HPLC-UV (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com detecção por ultravioleta).
O conhecimento da alta produção, das condições ambientais que possibilitam a contaminação micotoxicológica do trigo, geram a necessidade do desenvolvimento de metodologias analíticas precisas, que demonstrem dados sobre a ocorrência e os níveis de contaminação, bem como o risco toxicológico que humanos e animais estão submetidos.
MATERIAL E MÉTODOS: As amostras foram fortificadas com 1,5µg/mL de cada micotoxina 24h antes da extração.
QuEChERS: Foram pesados 10g de amostra e adicionados 20mL de água destilada e 20mL de acetonitrila. A mistura foi agitada em shaker (5min/800g) e, após, adicionados 1,5g de sulfato de magnésio e 0,85g de acetato de sódio e agitada por 5min em vortex. O extrato foi centrifugado (10min/5000rpm) e adicionados 0,3g de sulfato de magnésio e 0,2g de celite em 6mL do sobrenadante e agitou-se por 1min. O sobrenadante (3mL) foi seco sob nitrogênio.
Tanaka: Foram pesados 10g de amostra e adicionados 100mL da mistura acetonitrila:água (3:1). A mistura foi agitada em shaker (30min/800g) e filtrada para um balão de separação. No balão foi adicionado 3 x 10mL de hexano para a limpeza. Adicionou-se 1g de NaCl e agitou-se. A fração superior foi recolhida em balão de fundo chato e rotaevaporada a 70ºC até a secura. No balão adicionou-se 3mL de metanol e 27mL de clorofórmio e centrifugou-se (10min/5000rpm). O sobrenadante foi seco em banho-maria a 60ºC.
MSPD: Pesou-se 1g de amostra em almofariz e misturou-se 1g de C18 durante 5min. A mistura foi introduzida em um tubo com 20mL de acetonitrila/metanol (50/50,v/v) e agitada em vortex por 1min. Após, colocou-se o tubo em banho ultrassônico(25mHZ) por 10min e centrifugou-se (5min/5000rpm). O extrato obtido foi evaporado até à secura.
DLLME: Foi adicionado 440µL de clorofórmio à uma alíquota de 2mL de extrato, obtido pela técnica SLE, em um tubo de centrífuga contendo 6mL de água. O tubo foi agitado em vortex (30seg). Formou-se uma solução turva e esta foi centrifugada (5min/5000rpm). Removeu-se a maior parte do sobrenadante e transferiu-se 300µL da fase sedimentada de clorofórmio para um frasco. O extrato obtido foi seco sob um fluxo de nitrogênio.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Foi utilizado um sistema de HPLC Shimadzu com detecção espectrofotométrica (modelo SPD-20A). As análises foram realizadas utilizando-se uma coluna cromatográfica C-18 Gemini (250 x 4,6 mm, com partículas de 5 μm). A fase móvel utilizada foi constituída por acetonitrila:água (70:30, v/v), com eluição no modo isocrático e vazão de 0,5 mL min-1.
Limite de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ):
Para a determinação do LOD e do LOQ do instrumento foram realizadas injeções do mix de soluções padrão dos tricotecenos em ordem decrescente de concentração (2; 1; 0,5; 0,25; 0,1; 0,05 g mL-1). Foram obtidos como limite de detecção e quantificação instrumental 0,15 ug/mL e 0,5ug/mL, respectivamente.
Curva analítica e linearidade:
A linearidade do instrumento e dos métodos foi avaliada pela construção de curvas analíticas através da padronização externa com soluções analíticas do mix nas concentrações: 0,5; 1,25; 2,5; 5 e 10 μg mL-1. As curvas analíticas apresentaram fator de correlação superior a 0,90, conforme recomendação do INMETRO.
Recuperação:
A recuperação dos métodos de extração foi avaliada após fortificação da amostra de trigo (isenta de micotoxinas) em níveis de 1,5ug/mL de cada micotoxina.
Em concentrações mais altas, os picos dos ADONS se unem, bem como o de DON e DE-DON, isto ocorre por possuírem estruturas semelhantes, tornando-se difícil a separação em concentrações menores. Desta forma, as recuperações foram calculadas juntas para DON e DE-DON e para 3-ADON e 15-ADON.
Recuperações:
QuEChERS: DON/DE-DON=89%;ADONS=78%;NIV=87%;
DLLME: DON/DE-DON=62%;ADONS=50%;NIV=61%;
Tanaka: DON/DE-DON=118%;ADONS=110%;NIV=117%;
MSPD: DON/DE-DON=164%;ADONS=136%;NIV=128%.
Entre os métodos, os que ficaram entre a faixa de 80-120%(INMETRO) de recuperação foram QuEChERS e Tanaka.
CONCLUSÕES: Os resultados obtidos permitiram concluir que os métodos de extração QuEChERS e Tanaka e quantificação por HPLC/UV empregados para determinação dos tricotecenos em grãos de trigo proporcionaram maior eficiência na recuperação dos tricotecenos. No entanto, o procedimento QuEChERS é um método fácil e rápido e ainda diminui consideravelmente a quantidade de solventes necessários. Dessa forma, QuEChERS se mostrou um método promissor e eficiente para a determinação de micotoxinas em amostras de cereais.
AGRADECIMENTOS: À FURG - Universidade Federal do Rio Grande;
Ao PPGQTA - FURG;
Ao Laboratório de Micotoxinas - FURG;
Ao Laboratório de Ciências de Alimentos - FURG.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BEMVENUTI, R. H.; HACKBART, H. C. S.; SOUZA,M. M.; BADIALE-FURLONG, E.; DORS, G. C.; FAGUNDES, C. A. Determinação de deoxinivalenol e zearalenona em arroz natural e parboilizado e suas frações utilizando quechers e hplc/uv-fl. Química Nova, v XY, Nº0, p. 1-6, 2012.
CAMPONE,L.;PICCINELI,R.C.;RASTRELLI,L.Application of dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of aflatoxins B1,B2,G1 and G2 in cereal products. Journal of Chromatography A, 1218, p.7648-7654, 2011.
FONSECA, H. Micotoxinas: perspectiva latinoamericana. Rio de Janeiro: Editora da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, v. 261, 1996.
Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade
Industrial (INMETRO); Orientações sobre Validação de Métodos de
Ensaios Químicos, DOQ-CGCRE-008. Revisão: 01, 2003.
LANGSETH, W.; RUNDBERGET, T. Instrumental methods for determination of nonmacrocyclic trichothecenes in cereals, foodstuffs and cultures. Journal of Chromatography A, v. 815, p. 103-121, 1998.
RUBERT, C. SOLER, J. MAÑES. Evaluation of matrix solid-phase dispersion (MSPD) extraction for multi-mycotoxin determination in different flours using LC–MS/MS. Talanta, v. 85, p. 206-215, 2011.
TANAKA, T.; YONEDA, A.; INOUE, S.; SUGIURA, Y.; UENO, Y.; Simultaneous determination of trichothecene mycotoxins and zearalenone in cereals by gas chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v. 882, 2000.
TURNER, N. W.; SUBRAHMANYAM, S.; PILETSKY, S. A. Analytical methods for determination of mycotoxins: A review. Analytica Chimica Acta, v. 632, p. 168-180, 2009.