Realizado no Rio de Janeiro/RJ, de 14 a 18 de Outubro de 2013.
ISBN: 978-85-85905-06-4
ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: Espectroscopia de impedância eletroquímica aplicada ao estudo de nanocompósito de ouro e polianilina para o desenvolvimento de biossensor para dengue clássica e hemorrágica
AUTORES: Avelino, K.Y.P.S. (UFPE) ; Andrade, C.A.S. (UFPE) ; Melo, C.P. (UFPE) ; Correia, M.T.S. (UFPE) ; Coelho, L.C.B.B. (UFPE) ; Nogueira, M.L. (FAMERP) ; Oliveira, M.D.L. (UFPE)
RESUMO: Este trabalho possui como objetivo avaliar o processo de interação bioespecífico
do sistema constituído por lectina Concanavalina A (ConA) e nanocompósito de ouro
e polianilina (AuNpPANI) para detecção de glicoproteínas do soro de pacientes com
dengue clássica (DC) e hemorrágica (DH). A caracterização interfacial do filme
nanoestruturado e sua bioatividade foram realizadas através da espectroscopia de
impedância eletroquímica. A partir da análise dos resultados foi possível
verificar que a ConA reteve sua propriedade bioativa quando adsorvida em matriz de
AuNpPANI, apresentando padrões de reconhecimento para diferenciação dos soros de
DC e DH. Portanto, verifica-se o potencial de aplicabilidade do biossistema para o
desenvolvimento de sensores eletroquímicos para detecção da dengue.
PALAVRAS CHAVES: Biossensor; Dengue; Impedância eletroquímica
INTRODUÇÃO: A dengue é uma doença febril aguda ocasionada por um arbovírus pertence ao
gênero Flavivirus e família Flaviviridae, que se apresenta na forma de três
síndromes clínicas: dengue clássica, dengue hemorrágica e síndrome do choque da
dengue (HOBER et al., 1995). Considerando que a dengue possui um amplo espectro
clínico, a obtenção de um diagnóstico preciso é essencial para a implementação
de medidas terapêuticas eficazes. Os biossensores são dispositivos analíticos
que fornecem informações sobre substâncias específicas através de um elemento de
reconhecimento biológico associado a um transdutor (HULANICKI; GEAB; INGMAN,
1991). A lectina Concanavalina A é uma proteína isolada a partir de extratos de
Canavalia ensiformes que possui sítios de ligação para moléculas glicose e
manose, por esta razão, são utilizadas na construção de sistemas biossensíveis
(SUMNER e HOWELL, 1936). No entanto, a adsorção direta de biocomponentes em
superfícies metálicas pode resultar em diminuição ou perda de sua atividade
biológica. Desta forma, as nanopartículas de ouro e polianilina por apresentarem
biocompatibilidade e características elétricas e ópticas diferenciadas, tornam-
se elementos essenciais para a montagem de sistemas de detecção (LI;
SCHLUESENER; XU, 2010). O presente estudo possui como objetivo avaliar a
capacidade de reconhecimento da lectina ConA imobilizada em filme
nanoestruturado de AuNpPANI frente a glicoproteínas do soro de pacientes com
dengue clássica e hemorrágica. Atualmente, a dengue é considerada a mais
importante virose que afeta o homem em termos de morbidade e mortalidade. Logo,
é de grande interesse para a saúde pública o desenvolvimento de novas
tecnologias de diagnóstico, como os biossensores, reconhecidos por sua
sensibilidade e seletividade.
MATERIAL E MÉTODOS: A técnica de espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) foi utilizada como
ferramenta biotecnológica para avaliação dos processos analíticos interfaciais.
Para realização das análises eletroquímicas, foi utilizado um
Potenciostato/Galvanostato Autolab 128N associado a uma célula convencional de
três eletrodos imersos em solução de 10 mM de ferro-ferricianeto de potássio em
uma proporção de 1:1 (v/v). O eletrodo de trabalho utilizado foi o eletrodo de
ouro modificado, o eletrodo de contra-referência foi o eletrodo de platina e o
de referência o eletrodo de Ag/AgCl saturado com KCl. Os espectros da EIE foram
obtidos numa faixa de freqüência entre 100 mHz a 100 KHz com um potencial de
amplitude alternada de 10 mV. Inicialmente, a superfície de ouro do eletrodo de
trabalho foi polida em um disco de feltro com uma suspensão de alumina com
granulação de 0,05 µm e submetida a um banho ultra-sônico por 5 minutos. O
sistema AuNpPANI-ConA foi preparado a partir de uma mistura de lectina
Concanavalina A (200 µg/mL) e nanocompósito de ouro e polianilina em uma
proporção de 1:2 (v/v). Para modificação da superfície eletroativa, o eletrodo
foi imerso por 2 minutos no sistema híbrido AuNpPANI-ConA. Em seguida, o
eletrodo de ouro biomodificado foi incubado por 2 minutos nos soros de pacientes
contaminados com DC e DH. Em adição, foi avaliada a interação lectina-
carboidrato em soros de pacientes não infectados. Estes soros biológicos foram
previamente diluídos em solução tampão fosfato de sódio a 10 mM e pH 7,4. É
importante destacar que sucessivas caracterizações eletroquímicas do sistema
biossensível foram realizadas antecipadamente com o objetivo de analisar sua
reprodutibilidade e estabilidade, propriedades essenciais para construção de um
biodispositivo nanoestruturado.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A figura 1 corresponde ao estudo impedimétrico das etapas de montagem do
biodispositivo e sua bioatividade após a exposição aos soros de pacientes com
dengue clássica (DC) e hemorrágica (DH). Foi observado que a curva de impedância
para o eletrodo limpo em solução eletrolítica possui um semicírculo bastante
pequeno e um comportamento quase linear. A adsorção do complexo AuNpPANI-ConA
origina uma camada auto-organizada sobre a área eletroativa bloqueando
parcialmente o processo de oxido-redução dos eletrólitos na superfície do
eletrodo biomodificado em decorrência do aumento da resistência à transferência
de elétrons. Ao analisar a atividade biomolecular do sistema híbrido AuNpPANI-
ConA verifica-se que a lectina ConA reconhece resíduos de açúcares presentes em
proteínas expressas nos soros de DC e DH, podendo esta interação ser
identificada através do aumento da resistividade do sistema quando o eletrodo
biossensível é exposto as glicoproteínas de interesse biológico. A resposta
bioativa do dispositivo nanoestruturado também foi avaliada frente ao soro de
pacientes não contaminados (soro negativo - SN). A partir do estudo
eletroquímico pode-se observar que o biossensor é capaz de reconhecer
glicoproteínas em estados de homeostase, entretanto, o grau de interação lectina
ConA-carboidratos é diferenciado em relação aos soros de DC e DH. Recentemente,
um estudo realizado por Oliveira et al. (2009) baseado na atividade de
biorreconhecimento da lectina Concanavalina A imobilizada em eletrodo de ouro
modificado com nanopartículas ouro, polivinilbutiral e albumina do soro bovino
apresentou afinidade para glicoproteínas anormais do plasma de pacientes
contaminados com dengue. Desta forma, pode-se verificar a autenticidade da
interação bioespecífica da lectina ConA-carboidratos.
Figura 1
Estudo impedimétrico da atividade do sistema
AuNpPANI-ConA frente a glicoproteínas do plasma de
pacientes com DC, DH e de indivíduos não infectados.
CONCLUSÕES: A partir das informações experimentais, pode-se concluir que o biodispositivo
nanoestruturado constituído por lectina Concanavalina A e nanocompósito híbrido
biofuncionalizado é capaz de detectar glicoproteínas presentes no soro de
pacientes com dengue clássica e hemorrágica através do reconhecimento
bioespecífico. Portanto, por apresentar seletividade, reprodutibilidade e
diferentes padrões de interação lectina-carboidrato para os soros em estudo, o
sistema AuNpPANI-ConA poderá ser utilizado para a construção de um método
diagnóstico mais sensível, rápido e com menos custos para a Dengue.
AGRADECIMENTOS: CNPq, CAPES-Rede nanobio/ELINOR, FACEPE.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: HOBER, D.; ROULIN, G.; DEUBEL, V.; WATTRE, P. 1995. La dengue: une maladie virale en pleine expansion. Méd. Mal. Infect., 25: 888-895.
HULANICKI, A.; GEAB, S.; INGMAN, F. 1991. Chemical sensors: definitions and classification. Pure & Appl. Chem., 63: 1247-1250.
LI, Y.; SCHLUESENER, H.J.; XU, S. 2010. Gold nanoparticle-based biosensors. Gold Bulletin, 43: 29-41.
OLIVEIRA, M.D.L.; CORREIA, M.T.S.; DINIZ, F.B. 2009. A novel approach to classify serum glycoproteins from patients infected by dengue using electrochemical impedance spectroscopy analysis. Synthetic Metals, 159: 2162–2164.
SUMNER, J.S.; HOWELL, S.F. 1936. The identification of the hemagglutinin of the jack bean with Concanavalin A. Journal of bacteriology, 32(2): 227-237.