Realizado no Rio de Janeiro/RJ, de 14 a 18 de Outubro de 2013.
ISBN: 978-85-85905-06-4
ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: Desenvolvimento de um genossensor para M. tuberculosis baseado em nanopartículas magnéticas de óxido ferro.
AUTORES: Palmeira da Costa, M. (UFPE) ; Souza de Andrade, C.A. (UFPE) ; Lopes de Melo, F. (CENTRO DE PESQUISA AGGEU MAGALHÃES) ; Lima de Oliveira, M.D. (UFPE)
RESUMO: O presente trabalho objetiva avaliar o sistema formado pelo ácido p-aminobenzóico
(APB)e nanopartículas magnéticas de óxido de ferro (NPsFe3O4) como suporte de
imobilização de primer de tuberculose(TB1)para detecção do genoma de Micobacterium
tuberculosis(MTB) isolado de pacientes infectados.A caracterização do biossistema
foi através das técnicas eletroquímicas voltametria cíclica e espectroscopia de
impedância eletroquímica que avalia as propriedades elétricas do sistema APB-
NPsFe3O4-primerTB1.Os resultados demonstraram que o biossistema primerTB1 foi
adsorvido à superfície do eletrodo modificado com APB-NPsFe3O4 e detectou o genoma
do MTB por aumento da resistência de transferência de carga. Desta forma o sistema
baseado em APB-NpsFe3O4-TB1 demonstra ser útil na detecção do MTB.
PALAVRAS CHAVES: Impedância eletroquímica; nanopartículas; M. tuberculosis
INTRODUÇÃO: A tuberculose(TB) é uma infecção bacteriana causada pelo Mycobacterium
tuberculosis (MTB) e representa mundialmente um problema de saúde pública.
Atualmente é de extrema importância o desenvolvimento de um teste rápido e
eficiente para a identificação de MTB,pois através do sistema público de saúde
os testes clínicos são dependentes de cultura necessitando de tempo para o
crescimento do microrganismo(Arya et al., 2012). Desta forma, o uso de
biossensores de DNA para a detecção das sequências nucléicas proporciona uma
enorme probabilidade de diagnóstico de doenças, análise de drogas e análises
forenses (Liao et al., 2007).As nanopartículas de óxido de ferro (NPsFe3O4) têm
sido utilizadas para a imobilização de biomoléculas devido às suas propriedades
que as tornam elementos essenciais para o desenvolvimento de sistemas
biossensíveis para hibridização de DNA (Son et al., 2007).Associada com o ácido
p-aminobenzóico advém da possibilidade do uso deste sistema para imobilização
covalente do biosistema na superfície do eletrodo. O presente estudo possui como
objetivo avaliar o processo adsortivo do primer para tuberculose (TB1 e analisar
a resposta de hibridização do biodispositivo após a interação do primer com o
genoma de MTB. Atualmente, a tuberculose é considerada um grave problema de
saúde pública infecciosa e transmissível, que afeta prioritariamente os pulmões,
embora possa acometer outros órgãos e sistemas. Portanto, é de grande
importância o desenvolvimento de novas tecnologias de biodetecção rápida,
seletiva e sensível para a tuberculose (Garg et al., 2003).
MATERIAL E MÉTODOS: As análises de voltametria cíclica(VC)e espectroscopia de impedância
eletroquímica (EIE) foram realizadas em um potenciostato/galvanostato Autolab
PGSTAT 128N,numa célula convencional de três eletrodos. O eletrodo de trabalho
(ET) utilizado foi de ouro modificado, o eletrodo de referência foi o de Ag∕AgCl
saturado com KCl e o contra-eletrodo foi o de referência foi o Ag/AgCl saturado
com KCl. As medidas foram realizadas na solução de ferro-ferricianeto de
potássio [K4(Fe(CN)6)/K3(Fe(CN)6)] (1:1) em tampão fosfato de sódio (TFS) a 10mM
numa faixa de frequência entre 100 mHz a 100 KHz com um potencial de amplitude
alternada de 10 mV. As análises de VC foram realizadas em diferentes etapas de
construção do biodispositivo, a um potencial de varredura fixo de -0,4 a 0,7 V,
a temperatura ambiente e no interior de uma gaiola de Faraday.De inicio, a
superfície de ouro foi polida em um disco de feltro com uma suspensão de alumina
e, em seguida, lavada com água deionizada e submetida à sonicação por 5 minutos
para remoção de partículas residuais. Para a montagem do biossensor, o eletrodo
de trabalho foi submetido a 2uL da solução de APB (5mM) por 2 minutos e em
seguida ativado pela mistura de N-(3-Dimetilaminopropil)N-etilcarbodiimida
(EDC):N-hidroxisuccinimida (NHS). Posteriormente, as NpsFe3O4 foram modificadas
com aminopropiltrimetoxisilano (APTES) e em seguida depositadas sobre o ET
modificado com APB, sendo obtido o sistema APB-NpsFe3O4. Após este processo o
primer aminado foi imobilizado sobre a superfície do sistema APB-NpFe3O4
(30min). O biosistema APB-NpsFe3O4-primer foi submetido ao genoma de M.
tuberculosis (6ng/ul) para avaliação de sua capacidade de detecção por 30min e
posteriormente, enxaguado suavemente para separação das moléculas não
reconhecidas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: As respostas voltamétricas e impedimétricas refletem as alterações da
transferência de elétrons entre o par redox Fe(CN)6]4- ∕ [Fe(CN)6]3- e a
superfície do eletrodo após cada processo de montagem do biossensor. Os
voltamogramas demonstram que as respostas para o eletrodo de ouro limpo,
eletrodo modificado com APB, APB-NpsFe3O4, APB-NpsFe3O4-primerTB1 e APB-
NpsFe3O4-primerTB1-MTB apresentaram uma diminuição gradual das áreas
voltamétricas e das correntes de pico catódicas (ipcat) e anódicas (ipan), com
exceção quando o sistema foi exposto ao EDC:NHS, processo este que refletiu um
aumento das áreas avaliadas (Fig. 1). Já as respostas impedimétricas estão de
acordo com as análises de VC, de modo que, a redução da ipcat e ipan após cada
etapa de modificação do biodispositivo, refletiu um aumento da resistência de
transferência de carga (RCT). Após a formação da camada APB-NpsFe3O4-primerTB1
sobre o eletrodo, houve uma variação da RCT de 800 Ω para 50 kΩ, indicando a
correta deposição do sistema sobre o eletrodo de ouro. Além disso, quando o
biosistema foi exposto ao MTB ocorreu novo incremento na RCT (72 kΩ),
demonstrando a capacidade de reconhecimento biológico do sistema obtido via
hibridização. Os resultados obtidos estão de acordo com os dados da literatura,
que demonstram a possibilidade de desenvolvimento de genossensor baseado em
nanopartículas magnéticas de óxido de ferro (Son et al., 2007). Também,
Nascimento et al. (2011) avaliou o uso de nanocompósito de ouro e polianilina
como sistema de imobilização de sondas e detecção de genoma de dengue em
análises impedimétricas com extração de RCT.Estes estudos demonstram a
viabilidade do uso de nanopartículas magnéticas e de ouro para o desenvolvimento
de biossensores para DNA ou proteínas.
VOLTAMETRIA CICLICA
Figura1- Voltamogramas cíclicos para as diferentes
etapas de modificação do eletrodo de ouro e
biodetecção de MTB pelo sistema APB-NpFe3O4-TB1.
CONCLUSÕES: As análises de VC e EIE demonstraram o processo de adsorção/imobilização do
sistema APB-NpSFe3O4-TB1 e de biointeração do sistema APB-NpsFe3O4-TB1 com o
genoma de MTB. Pode-se concluir que o sistema APB-NpsFe3O4-TB1 apresentou uma boa
resposta de RCT para o processo de hibridização TB1-MTB. Desta forma, o
biossistema APB-NpsFe3O4-TB1 apresentou boa reposta para a detecção do MTB e
poderá ser utilizado para a construção de um sistema de biodetecção rápido e
sensível para a detecção da tuberculose.
AGRADECIMENTOS: FACEPE, CNPq e Rede Nanobiotecnologia-CAPES.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: 1. Arya, S.K., Sahab, S., Ramirez-Vickc, J. E., Gupta, V., Bhansalid S., Singh, P. Anal. Chim. Acta 737 (2012) 1.
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