Realizado no Rio de Janeiro/RJ, de 14 a 18 de Outubro de 2013.
ISBN: 978-85-85905-06-4
ÁREA: Alimentos
TÍTULO: Identificação de Benzilpenicilina G Benzatina em formulações injetáveis: Um diagnóstico preliminar para análise dos resíduos β-lactâmicos em leite.
AUTORES: Cabral, A.M. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE) ; de Moura, M.F.V. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE) ; da Silva, D.R. (UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE)
RESUMO: O uso da penicilina para tratamento de infecções provocada por bactérias gram-negativas (Escherichia coli) em animais produtores de alimentos é prática corriqueira na medicina veterinária. Contudo, o uso inadequado desse antibiótico pode gerar resíduos nos alimentos. Desta forma, este trabalho realiza um estudo preliminar para identificação da Benzilpenicilina G Benzatina por cromatografia líquida de alta eficiência com arranjo de fotodiodos (HPLC-DAD). Inicialmente, foi realizado a otimização das condições cromatográficas, considerando-se o método (M1), pois fornece o menor tempo de retenção e resolução do pico. Os resultados encontrados mostraram o método é adequado para identificação de Penicilina, com base no limite máximo de resíduos (LMR) de 50 µg/Kg.
PALAVRAS CHAVES: Penicilina G Benzatina; LMR; HPLC-DAD
INTRODUÇÃO: A descoberta de Alexandre Fleming, em 1929, da produção de uma substância (penicilina) antibacteriana produzida por culturas Penicillium notatum e a subsequente purificação por Florey, Chain, lançou o quimioterapêutico antibacteriano em revolução bem sucedida para tratamento de infecções provocada por bactérias gram-negativas em pacientes humanos (RAISON-PEYRON et al., 2001; REEVES, 2011). Atualmente, o uso desta substância estendeu-se para a manutenção da saúde de animais produtores de alimentos.Porém, uso inadequado desses antibióticos pode resultar em altas concentrações de resíduos em alimentos expostos ao consumo humano. De modo que, a segurança dos alimentos é um tema muito relevante, devido principalmete, a busca da sociedade por uma melhor qualidade de vida e de adquirir produtos seguros, de igual modo as legislações de todo mundo, inclusive no Brasil através do Plano Nacional de Resíduos e Contaminantes (PNRC) estabelecem métodos e limitam a quantidade desses resíduos pelo limite máximo de resíduos (LMR). Para um controle da presença desses resíduos, uma das técnicas mais referenciada é a Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) que tem sido utilizada para a análise simultânea de penicilinas em fluidos biológicos (soro, plasma e urina), formulações farmacêuticas, produtos alimentícios de origem animal origem utilizando diferenciados detectores (BAILÓN-PÉREZ et al., 2009; KANTIANI et al., 2009; KARAGEORGOU; SAMANIDOU, 2011; RAMBLA-ALEGRE et al., 2011; RIEDIKER; DISERENS; STADLER, 2001; VAN HOLTHOON et al., 2010). Neste contexto, este trabalho aplica o HPLC-DAD para identificação da penicilina em amostra de medicamentos injetáveis para realizar um estudo preliminar das melhores condições para identificação dos resíduos deste antibiótico em alimentos.
MATERIAL E MÉTODOS: PREPARO DAS SOLUÇÕES: PROCEDIMENTO DA FARMACOPÉIA AMERICANA (USP XXVIII, 2005)
A partir de uma suspensão injetável de uso hospitalar de concentração 600.000 UI (estoque de 77, 6367 mg/mL) de benzilpenicilina benzatina foi preparado por adição de padrão externo uma solução de 2 ng/mL diluído em água milipore® Milli Q (resistividade > 16 MΩ). As soluções foram filtradas em filtro de seringa de nylon Milipore 13 mm x 0,45 µm.
OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
As análises foram realizadas em sistema cromatográfico UFLC SHIMADZU®, MODELO LC-20 da Shimadzu. A coluna era de fase reversa de C8 (4,6 mm x 25 cm, 5 μm). A eluição binária consistiu de fase A (água MiliQ 80 %) e fase B (acetonitrila grau HPLC) 20 % . O fluxo da coluna era 1 mL/min, a temperatura era de 40 °C. O modo de injeção por loop com limite 5µL. O detector utilizado foi com arranjo de fotodiodos, o comprimento de onda foi selecionado de acordo com o máximo de absorbância para cada família de betalactâmicos, sendo de 220 nm referenciado para penicilina. Os dados foram coletados pelo software LCSolution da Shimadzu®.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: No estudo apresentado foram testadas diversas composições e fluxos das fases móveis, baseados e adaptados do trabalho Perez-Bailon et al (2009), eles mencionam que, o método cromatográfico acoplado com detector no ultravioleta visível é aplicável para elaboração de uma metodologia válida, para a determinação de resíduos de antibióticos beta-Lactâmicos de uso humano e veterinário, dentre eles a penicilina V e penicilina G. Os pesquisadores afirmam que o método mostrou as vantagens de HPLC capilar para a detecção destes antibióticos largamente aplicados em diferentes amostras com níveis muito baixos de concentração permitidos. De modo que, o presente trabalho de identificação, através de um programa de eluição de duas etapas (método 1 e 2), rendeu satisfatória identificação da penicilina em tempo de dentro de 10 min e baseado nos protocolos de preparo das soluções no Manual da Farmacopéia americana - United States Pharmacopeial Convention (USP XXVIII, 2005). De forma que, os resultados (tabela com apresentação dos cromatogramas e espectro na região do visível) ótimo método (1), considerando os valores do tempo de retenção, bem como a sua ótima seletividade e eficiência para identificação das penicilina com tempo de retenção (R) em torno de 2,5 minutos.
Resultados da Análise Cromatográfica
Gráfico Original da Análise cromatográfica com detecção por ultravioleta visível cuja faixa de trabalho foi determinada em 220 nm.
Otimização das Condições do sistema cromatográfico
A Figura apresentada ilustra as principais condições aplicadas ao sistema cromatográfico (HPLC-UV).
CONCLUSÕES: O uso de substâncias com finalidades terapêuticas em animais produtores de alimentos, requer a investigação da persistência dos resíduos e limite de tolerância, de forma que não constituam em risco aos consumidores. Este estudo, para identificação de benzilpenicilina G benzatina em formulações injetáveis e adaptado para as condições do sistema cromatográfico UFLC-UV, mostrou bons resultados, pois combina especificidade, sensibilidade, reprodutibilidade, efetividade e pode ser aplicado no rastreio dos resíduos de (PEN) em leite, apenas com a otimização e posterior validação do método.
AGRADECIMENTOS: Os autores agradecem a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BAILÓN-PÉREZ, M. I. et al. Trace determination of 10 beta-lactam antibiotics in environmental and food samples by capillary liquid chromatography. Journal of chromatography. A, v. 1216, n. 47, p. 8355–61, 20 nov. 2009.
KANTIANI, L. et al. Fully automated analysis of beta-lactams in bovine milk by online solid phase extraction-liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry. Analytical chemistry, v. 81, n. 11, p. 4285–95, 1 jun. 2009.
KARAGEORGOU, E. G.; SAMANIDOU, V. F. Development and validation according to European Union Decision 2002/657/EC of an HPLC-DAD method for milk multi-residue analysis of penicillins and amphenicols based on dispersive extraction by QuEChERS in MSPD format. Journal of separation science, p. 1893–1901, 4 jul. 2011.
BAILÓN-PÉREZ, M. I. et al. Trace determination of 10 beta-lactam antibiotics in environmental and food samples by capillary liquid chromatography. Journal of chromatography. A, v. 1216, n. 47, p. 8355–61, 20 nov. 2009.
RAISON-PEYRON, N. et al. Anaphylaxis to beef in penicillin-allergic patient. Allergy, v. 56, n. 8, p. 796–7, ago. 2001.
RAMBLA-ALEGRE, M. et al. Application of a liquid chromatographic procedure for the analysis of penicillin antibiotics in biological fluids and pharmaceutical formulations using sodium dodecyl sulphate/propanol mobile phases and direct injection. Journal of chromatography. A, v. 1218, n. 30, p. 4972–81, 29 jul. 2011.
REEVES, T. . Chemical Analysis of Antibiotic Residues in Food. In: WANG, J.; MACNEIL, J. D.; KAY, J. F. (Eds.). Chemical Analysis of Antibiotic Residues in Food age. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2011. p. 1–60.
RIEDIKER, S.; DISERENS, J. M.; STADLER, R. H. Analysis of beta-lactam antibiotics in incurred raw milk by rapid test methods and liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of agricultural and food chemistry, v. 49, n. 9, p. 4171–6, set. 2001.
VAN HOLTHOON, F. et al. Quantitative analysis of penicillins in porcine tissues, milk and animal feed using derivatisation with piperidine and stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. Analytical and bioanalytical chemistry, v. 396, n. 8, p. 3027–40, abr. 2010.
USP XXVIII, THE UNITED STATES PHARMACOPEIA. The National Formulary, 28th ed., United States Pharmacopeial Convention, Rockville, 2005.