Realizado no Rio de Janeiro/RJ, de 14 a 18 de Outubro de 2013.
ISBN: 978-85-85905-06-4
ÁREA: Alimentos
TÍTULO: Ocratoxinas em massas de pão
AUTORES: da Silva Graça, C. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE RIO GRANDE) ; Christ Ribeiro, A. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE RIO GRANDE) ; Muniz Moreira, L. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE RIO GRANDE) ; dos Santos Hackbart, H.C. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE RIO GRANDE) ; Badiale Furlong, E. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE RIO GRANDE) ; Almeida de Souza Soares, L. (UNIVERSIDADE FEDERAL DE RIO GRANDE)
RESUMO: O objetivo do trabalho foi comparar a eficiência de métodos de extração de
Ocratoxina A em pão por método em cromatografia delgada. Foram avaliados a
partir de amostras de 5 g de pão contaminadas com Ocratoxina A e extraídas com
os solventes acetonitrila, acetonitrila: metanol e hexano: acetona e agitadas
por 2 min. Após, foram adicionados os sais de sulfato de magnésio, cloreto de
sódio e citrato de sódio. Foram então centrifugadas e alíquotas de 1 mL de cada
amostra foram transferidas para frascos e evaporadas em banho a 60 °C. O cálculo
da recuperação foi através do programa Image J. O método de extração utilizando
acetonitrila:metanol indicou resultados promissores utilizando os sais de
sulfato de magnésio, cloreto de sódio e citrato de sódio recuperando em 101% a
ocratoxina A.
PALAVRAS CHAVES: micotoxinas; recuperação; camada delgada
INTRODUÇÃO: No Brasil, o setor de panificação é composto por aproximadamente 63 mil
panificadoras que atendem a 40 milhões de pessoas, diariamente. O Rio Grande do
Sul é um dos estados que concentra o maior número de estabelecimentos, sendo que
o consumo médio per capita de pão/ano no nosso país atinge 33,5 kg (PROPAN,
2012).
Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por alguns fungos, que podem
causar danos aos animais e ao homem devido ao seu potencial tóxico. Os produtos
agrícolas estão constantemente sujeitos à contaminação fúngica, e as principais
espécies de fungos toxigênicos com capacidade de produzir micotoxinas são
aquelas dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Micotoxinas associadas
aos grãos são uma das principais causas de não conformidade em relação a
alimentos seguros e as impurezas e/ou matérias estranhas presentes podem estar
associadas à sua maior incidência (OLIVEIRA et al., 2010).
A ocratoxina A (OTA) tem estrutura química semelhante à das aflatoxinas, sendo
representada por uma isocumarina substituída, ligada a um grupo L- fenilalanina;
é produzida por fungos da espécie Penicillium e Aspergillus e ocorre
naturalmente em todo o mundo em diversos produtos vegetais, como produtos à base
de cereais (NOGUEIRA e OLIVEIRA, 2006).
As técnicas mais utilizadas para separação de micotoxinas são basicamente
cromatográficas onde a cromatografia em camada delgada se destaca por ser a mais
simples, pois além de ser empregada em métodos de triagem também é aplicada na
separação e quantificação das micotoxinas (KAWASHIMA, 2004).
Portanto, o objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência de métodos de
extração de micotoxinas, através da utilização de diferentes solventes,
avaliando a recuperação de Ocratoxina A em pão por método de cromatografia
delgada.
MATERIAL E MÉTODOS: Contaminação e extração de ocratoxina A
De acordo com Paíga et al. (2012) com modificações, 5 g de pão foram
contaminadas com 60 ɳg/mL de ocratoxina A e submetidas a extração através de 4
métodos que utilizavam 40 mL de solventes diferentes: acetonitrila,
acetonitrila: metanol (1:1) e hexano: acetona (1:1). Foram agitadas por 2
minutos e adicionados sais que continham 4 g de sulfato de magnésio e 1g de
cloreto de sódio para a metodologia que usou como solvente a acetonitrila:
metanol. Para as outras 3 extrações, onde foram utilizados os sais contendo 6 g
de sulfato de magnésio, 1,5 g de cloreto de sódio e 1,5 g de citrato de sódio
foram utilizados os solventes acetonitrila, acetonitrila: metanol e hexano:
acetona. Foi novamente agitado por 1 minuto e então centrifugado por 15 minutos
para que alíquotas de 1 mL fossem transferidas para um frasco. Em seguida o
solvente foi evaporado em banho a 60 °C e o conteúdo dissolvido em 200 µL de
benzeno para a realização da cromatografia em camada delgada utilizando como
fase móvel tolueno, acetato de etila e ácido fórmico na proporção de 3:2:1.
Análise dos resultados
A partir de uma curva padrão de ocratoxina A (30 a 300 ng/mL) foi
verificado o coeficiente de linearidade (R2) de 0,9925 e obtida a equação do
gráfico a partir do programa Image J (Ferreira T. e Rasband W., 2011) que mede
por meio de fotografia a intensidade da fluorescência emitida pelas
concentrações crescentes das toxinas aplicadas na placa de camada delgada. As
amostras de cada método de extração contendo as micotoxinas foram gotejadas no
volume de 15 µL em placa de camada delgada para cada método. Após esta etapa
foram fotografadas e analisadas no programa onde os resultados foram calculados
a partir da equação do gráfico obtida.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A Tabela 1 apresenta as recuperações obtidas na análise cromatográfica em camada
delgada e os métodos com suas variáveis utilizadas.
De acordo com a Tabela 1, pode-se observar que todos os métodos, com exceção do
1, apresentaram recuperações maiores que 50%. O método 1 foi o que menos
recuperou a ocratoxina A, e se diferencia em relação apenas na adição dos sais
do método 2 que obteve a maior recuperação com a utilização do solvente de
acetonitrila: metanol (1:1). Isto remete a importância da escolha dos sais para
a extração da micotoxinas que, apresenta uma das principais funções, a limpeza
dos extratos. Além disso, apesar da utilização dos mesmos sais para diferentes
solventes aplicados, os resultados mostraram diferentes recuperações onde se
pode concluir que a seleção do solvente utilizado influência nas recuperações
devido ao fato que a separação da micotoxina de interesse dos demais componentes
da amostra acontece através da solubilização com um solvente adequado
(KAWASHIMA, 2004). Resultados semelhantes foram encontrados por Paíga et al.
(2012), onde para o mesmo solvente utilizado neste experimento, acetonitrila:
metanol, encontrou o valor de 88,1% de recuperação.
Tabela 1
CONCLUSÕES: Os métodos que empregaram diferentes solventes para a extração e recuperação da
micotoxina Ocratoxina A em amostras de pão, e sua comprovação por meio de
cromatografia em camada delgada, indicam diversidade em suas respostas,
destacando-se entre os mesmos o método 2 que utilizou acetonitrila e metanol na
proporção de 1:1 e 6 g de sulfato de magnésio, 1,5 g de cloreto de sódio e 1,5 g
de citrato de sódio.
AGRADECIMENTOS: Os autores agradecem à CAPES, ao CNPq e à FAPERGS.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: FERREIRA, T. & RASBAND, W. The ImageJ User Guide — Version 1.44, http://imagej.nih.gov/ij/docs/user-guide.pdf, 2011.
FREIRE, F. C. O. A Deterioração Fúngica de Produtos de Panificação no Brasil. (2011). Comunicado Técnico 174 - Embrapa. ISSN 1679-6535.
KAWASHIMA. L. M. (2004). Micotoxinas em alimentos e bebidas nacionais produzidos e comercializados em diferentes regiões do Brasil. Tese de doutorado em Engenharia de Alimentos na área de Ciência de Alimentos. Campinas – SP.
NOGUEIRA S., OLIVEIRA M. B. P. P. (2006). Prevalência de ocratoxina a em alimentos e consequentes problemas de segurança alimentar. Alimentação Humana. Vol 12, n° 2.
OLIVEIRA, M. A., LORINI, I. e MALLMANN, C. A. (2010). As micotoxinas e a segurança alimentar na soja armazenada. Braz. J. Food Technol., DOI: 10.4260/BJFT20101304114.
PAÍGA, P., MORAIS, S., OLIVA-TELES, T., CORREIA, M., DELERUE-MATOS, C., DUARTE, S. C., PENA, A. E LINO, C. M. (2012). Extraction of ochratoxin A in bread samples by the QuEChERS methodology. Food Chemistry 135, 2522–2528.
PROPAN- Programa de desenvolvimento de alimentação, confeitaria e panificação. http://www.propan.com.br/institucional.php?idcat=9. Acessado em julho, 2012.