52º CBQ - AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DO β-CAROTENO ASSOCIADO À FUMAÇA DE CIGARRO EM DUAS LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS: HL-60 E TH-29

ÁREA: Produtos Naturais

TÍTULO: AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE DO β-CAROTENO ASSOCIADO À FUMAÇA DE CIGARRO EM DUAS LINHAGENS DE CÉLULAS TUMORAIS: HL-60 E TH-29

AUTORES: Monte, D.S. (UFRPE) ; Tenório, J.A.B. (UFRPE) ; Silva, T.G. (UFPE) ; Militão, G.C.G. (UFPE) ; Ramos, C.S. (UFRPE)

RESUMO: Estudos, in vitro, indicaram que o β-caroteno (BC) pode inibir o crescimento de células humanas alteradas, sendo classificado como um possível anti-carcinogênico. Porém, a realização de dois grandes estudos clínicos (ATBC e CARET) demonstraram que altas dosagens de BC em seres humanos podiam aumentar a incidência de câncer de pulmão em indivíduos fumantes. Diante desse fato, o presente trabalho realizou testes de citotoxicidade do BC associado a fumaça do cigarro, em duas linhagens de células tumorais. Os resultados apresentaram uma CI50= 97,2 ± 1,1 e 66,1 ± 5,3 µg/mL para células HL-60 e HT-29, respectivamente, o que sugere aumento da toxicidade desta mistura quando comparado aos controles (BC e fumaça de cigarro).

PALAVRAS CHAVES: β-caroteno; fumaça de cigarro; citotoxicidade

INTRODUÇÃO: O câncer de pulmão era considerado uma doença rara até o início do século XX. Desde então, sua ocorrência aumentou rapidamente e essa neoplasia se tornou a mais frequente na população mundial e a causa mais importante de morte por câncer no mundo. Estimam-se 17.210 casos novos de câncer de pulmão em homens e 10.110 em mulheres, no Brasil, no ano de 2012. Esses valores correspondem a um risco estimado de 18 casos novos a cada 100 mil homens e 10 a cada 100 mil mulheres. (INCA, 2012) O consumo de frutas e vegetais ricos em carotenoides vem sendo correlacionados a redução da incidência de vários tipos de cânceres. O β-caroteno (BC), um dos carotenóides mais abundantes na natureza, é importante na nutrição humana devido a suas propriedades antioxidantes e por ser o precursor principal da vitamina A (KRINSKY, 1998; HELDEN, 2009). Briviba et al., 2001, trabalhando com carcinomas do cólon do útero, afirma que o BC é capaz de induzir apoptose em células carcinogênicas. Apesar de estudos in vitro considerarem o β-caroteno como anti-carcinogênico, os testes clínicos “α-tocopherol, β-carotene Cancer Prevention Study” (ATBC), realizado na Finlândia e o “Beta-carotene and Retinol Eficacy Trial” (CARET), realizado nos Estados Unidos. Mostraram que a suplementação de indivíduos, fumantes e não fumantes, com BC aumentou o risco de câncer em fumantes crônicos (OMENN et al., 1996; PALOZZA et al., 2006; LOWE et al., 2009). Várias hipóteses têm sido propostas para explicar os resultados negativos de BC associado com a fumaça do cigarro. Este trabalho teve como objetivo avaliar a citotoxicidade do BC e deste carotenóide associado à fumaça de cigarro nas células tumorais HT29 (carcinoma de cólon - humano) e HL60 (leucemia promielocítica).

MATERIAL E MÉTODOS: O β-caroteno foi adquirido da Sigma-Aldrich e o cigarro utilizado foi o da marca Hollywood Original. A fumaça de cigarro foi gerada com o auxílio de uma seringa de 50 mL, 02 tubos de silicones medindo 10 cm cada e uma pipeta de Pasteur. A fumaça do cigarro foi adquirida por sucção com a seringa, 50 mL desta fumaça foi borbulhada em balões volumétricos de 200 mL contendo, 40 mL de hexano (Controle), 10 mg de β-caroteno + 40 mL de hexano (Amostra), a cada 20 minutos, num período de 10 horas. Ao término, as amostras foram secas em rota-evaporador. As amostras, β-caroteno, fumaça de cigarro, β-caroteno + fumaça de cigarro, foram diluídas em DMSO, puro, estéril e testadas na concentração de 0,3 até 25 µg/mL para substâncias puras. A doxorrubicina foi usada como controle positivo. A Análise da citotoxicidade foi realizada pelo método do MTT, que é uma análise colorimétrica baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente ativas e tem a capacidade de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula (BERRIDGE et al., 1996). As células foram plaqueadas na concentração de 1 x 105 células/mL. As amostras foram diluídas em série no meio DMEN para obtenção das concentrações finais (50 μg/mL) e adicionadas em placa de 96 poços (100μL/poço). As placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO2 a 37ºC. Em seguida, foram adicionados 25 μL da solução de MTT, e as placas foram incubadas por 3h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com DMSO puro em espectrofotômetro a 595nm.

RESULTADOS E DISCUSSÃO: A tabela 1 demonstra os resultados obtidos pelos ensaios de citotoxicidade nas células tumorais HL-60 e HT-29, após 72 horas de incubação. Como se podem observar, ambas as células apresentaram uma alta Concentração de Inibição (CI50) em todas as amostras. A linhagem HL-60 mostrou-se mais sensível aos efeitos deletérios das amostras do que a linhagem HT-29. Como já dito anteriormente, os ensaios clínicos ATBC e CARET demonstraram que altas dosagens de BC podiam aumentar a incidência de câncer de pulmão em fumantes (LOWE et al., 2009). Apesar da alta CI50 das células submetidas à amostra de BC, o mesmo não é considerado tóxico, pois além de não terem aumentado o risco de câncer em indivíduos não fumantes, estudos já indicam que esta substância induz a célula alterada a apoptose, ou seja, a morte celular programada. A compreensão dos mecanismos apoptóticos, vem permitindo o desenvolvimento de novas estratégias no tratamento do câncer, e o β-caroteno já vêm sendo estudado neste aspecto (BRIVIBA et al., 2001; YANHONG et al., 2007). O tabagismo é considerado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) a principal causa de morte evitável em todo o mundo (INCA, 2012) e os resultados na tabela 01 reforça esta informação. Ao se analisar e comparar os resultados, podemos observar que ocorreu um sinergismo entre o BC e a fumaça do cigarro, pois, devido às propriedades antioxidantes do BC, era esperado que este carotenóide inibisse a ação dos radicais livres e substâncias danosas contidas na fase gasosa do cigarro. Estes dados obtidos podem ser utilizados para explicar o porquê dos ensaios clínicos acima citados não terem dado certo quando o indivíduo participante era fumante crônico (OMENN et al., 1996; PALOZZA et al., 2006; LOWE et al., 2009).

Tabela 01

Determinação do CI50 do β-caroteno, da fumaça de cigarro e do β-caroteno associado à fumaça de cigarro em linhagens celulares HL-60 e HT-29

CONCLUSÕES: Os testes citotóxicos realizados sugerem que o β-caroteno quando associado à fumaça do cigarro, interage de forma sinérgica entre as partes, perdendo suas propriedades antioxidantes, levando a um possível agravo dos efeitos deletérios da fumaça do cigarro nas células, explicando assim o provável motivo do aumento do risco de câncer nos testes clínicos ATBC e CARET.

AGRADECIMENTOS: PGQ/UFRPE e DA/UFPE.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BRIVIBA, K., SCHNÄBELE, K., SCHWERTLE, E., BLOCKHAUS, M., RECHKEMMER, G. 2001. β-Carotene Inhibits Growth of Human Colon Carcinoma Cells in Vitro by Induction of Apoptosis. Biol. Chem., Germany, 382:1663–1668.

HELDEN, Y.G.J., KEIJER, J., KNAAPEN, A.M., HEIL, S.G., BRIEDÉ , J.J., SCHOOTEN, J.J., GODSCHALK, W.L. 2009. β-Carotene metabolites enhance inflammation-induced oxidative DNA damage in lung epithelial cells. Free Radical Biology & Medicine, 46:299–304.
KRINSKY, N. I. 1998. The antioxidant and biological properties of the carotenoids. Ann NY Acad. Sci., 854:443-447.

INCA, 2012. Tabagismo no Mundo. Disponível em: <http://www1.inca.gov.br/tabagismo/frameset.asp?item=dadosnum&link=mundo.htm>. Acesso em: 07 Jul. 2012.

LOWE, G. M., VLISMAS, K., GRAHAM, D. L., CARAIL, M.,CARIS-VEYRAT, C., YOUNG, A. J. 2009. The degradation of (all-E)-b-carotene by cigarette smoke. Free Radical Research, 1-7.
OMENN, G. S., GOODMAN G. E., THORNQUIST, M. D., BALMES, J., CULLEN, M. R., GLASS, A., KEOGH, J. P., MEYSKENS, F. L. JR, VALANIS, B., WILLIAMS, J. H. JR., BARNHART, S., HAMMAR, S. 1996. Risk factors for lung cancer and for intervention effects in CARET, the Betacarotene and Retinol Efficacy Trial. J. Natl Cancer Inst, 334(18):1550-1559.

PALOZZA, P., SERINI, S., TROMBINO, S., LAURIOLA, L., RANELLETTI, F.O., CALVIELLO, G. 2006. Dual role of β-carotene in combination with cigarette smoke aqueous extract on the formation of mutagenic lipid peroxidation products in lung membranes: dependence on pO2. Carcinogenesis. 27(12): 2383–2391.

YANHONG,C., ZHONGBING LU, LIN BAI, ZHENHUA SHI, WEN-EN ZHAO, BAOLU ZHAO. 2007. β-Carotene induces apoptosis and up-regulates peroxisome proliferator-activated receptor γ expression and reactive oxygen species production in MCF-7 cancer cells. Europen Jornal of Cancer, 43:2590-2601.