ÁREA: Produtos Naturais
TÍTULO: Metabólitos bacterianos ativos in vitro e in silico contra Meloidogyne exigua
AUTORES: Ferreira Oliveira, D. (UFLA) ; Santos Júnior, H. (UFLA) ; Nunes, A. (UFLA) ; Paulo Campos, V. (UFLA) ; S. Canutors Pinho, R. (UFLA) ; Cardoso Gajo, G. (UFLA)
RESUMO: Dos metabólitos de Bacillus cereus e B. subtilis se isolaram uracila, 9H-purina e diidrouracila, cuja CL50 contra Meloidogyne exigua foi inferior à do nematicida comercial carbofuran. Como a diidrouracila era semelhante a ligantes de fosforibosiltransferases, que são importantes para o nematoide, montou-se uma sequência de aminoácidos para uma fosforibosiltransferase de M. incognita a partir do seu genoma. Tal sequência foi modelada, complexada com 9H-purina e diidrouracila, otimizada e submetida a processo de dinâmica molecular. As constantes de dissociação de tais substâncias à enzima eram, respectivamente, de 1.6 x 10-6 e 8.3 x 10-7 mol/L. Concluindo, as substâncias isoladas e a enzima modelada apresentam potencial para uso no desenvolvimento de produtos para o controle de M. exigua.
PALAVRAS CHAVES: Meloidogyne; bactéria; nematicida
INTRODUÇÃO: Os nematoides parasitas de plantas representam uma constante fonte de problemas para os agricultores brasileiros, que podem sofrer grandes prejuízos em decorrência da atuação desses animais (DIAS-ARIEIRA et al., 2010). Para exemplificar é possível mencionar o nematóide de galhas Meloidogyne exigua, que pode ser encontrado em 22 % das fazendas cafeeiras do Estado de Minas Gerais (CASTRO et al., 2008), que é responsável por 50% da produção brasileira de café (MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO - MAPA, 2012). Infelizmente, os métodos mais utilizados para o controle deste nematoide se baseiam no emprego de nematicidas de elevado poder biocida (CAMPOS and SILVA, 2008), que aumentam os custos de produção e contaminam o homem e o ambiente com substâncias de elevadas toxicidades (CHITWOOD, 2002). Uma possibilidade para contornar tal problema diz respeito ao uso de substâncias de origem bacteriana, já que as atividades nematicidas de alguns metabólitos bacterianos foram comprovadas (CRONIN et al., 1997). Logo, com vistas a contribuir para o desenvolvimento de produtos mais eficientes e de custo e toxicidade mais baixos, para o controle de M. exigua, os metabólitos produzidos por Bacillus subtilis e B. cereus foram submetidos a fracionamento direcionado por testes com M. exigua. Em seguida, as substâncias ativas isoladas foram utilizadas em estudo in silico para elucidar o mecanismo de ação de tais substâncias.
MATERIAL E MÉTODOS: Após o cultivo das bactérias em meio líquido TSB por sete dias, a 28 oC, removeram-se as células bacterianas e os líquidos foram liofilizados. As frações solúveis em diclorometano foram submetidas a fracionamento em coluna de silica gel do tipo flash, empregando-se os seguintes eluentes: hexano, hexano/ACOEt, ACOEt, MeOH, água e HCl a 0,1 mol/L. As frações eluídas com MeOH foram fracionadas em aparelho de CLAE (HPLC) equipado com coluna Si-C18 semipreparativa. Dos metabólitos de B. cereus se isolou a uracila, enquanto de B. subtilis se isolaram diidrouracila, uracila e 9H-purine. Todas as substâncias isoladas foram submetidas a teste com M. incognita em concentração fixa. A diidrouracila também foi empregada em testes com diferentes concentrações para a determinação da sua concentração letal para 50 % da população do nematoide (CL50). Com vistas a elucidar o mecanismo de ação de tais substâncias, buscaram-se enzimas cujos substratos tivessem semelhança estrutural com a diidrouracila, o que permitiu selecionar as fosforibosiltransferases. A seguir, com base no genoma de M. incognita, montou-se a sequência de aminoácidos de uma fosforibosiltransferase para ser modelada por homologia e complexada com 9H-purina e diidrouracila. Os complexos foram minimizados e colocados em caixa de água para serem submetidos a processo de dinâmica molecular até estabilização do desvio quadrático médio em relação à estrutura inicial (RMSD). Em seguida, calcularam-se as energias livres de ligação das referidas substâncias à enzima por MM-PBSA (molecular mechanics-Poisson Boltzmann surface area), utilizando-se as estruturas dos últimos 200 ps de cada simulação.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Observou-se que as frações dos metabólitos bacterianos solúveis em diclorometano eram ativas contra M. incognita. Logo, tais frações foram sub-fracionadas por cromatografia em coluna. Aquelas eluídas com MeOH eram as mais ativas e de maiores massas. Consequentemente, foram empregadas no fracionamento seguinte por CLAE, que resultou no isolamento de três substâncias ativas contra o nematoide: uracila, diidrouracila e 9H-purina. A mais ativa de todas (diidrouracila) apresentou CL50 contra o nematóide igual a 204 µg/mL, enquanto para o nematicida comercial carbofuran (metilcarbamato de 2,2-dimetil-2,3-diidro-1-benzofuran-7-ila) a CL50 era de 260 µg/mL. A seleção da fosforibosiltransferase como um possível alvo da diidrouracila pareceu razoável, já que parasitas como aqueles do gênero Meloidogyne são incapazes de sintetizar bases purínicas através de rotas de novo (LIU et al., 2006). Inicialmente, procurou-se trabalhar com o genoma de M. exigua, mas os resultados não foram satisfatórios. Em decorrência, utilizou-se o genoma de M. incognita, sobre o qual se tem informações mais amplas e precisas. Para o cálculo das energias livres de ligação da diidrouracila ou da 9H-purina à enzima se levaram em consideração as interações intermoleculares de van der Waals e Coulombicas, bem como as energias de solvatação polar e apolar. A entropia foi considerada por valores parametrizados (CUI et al., 2008). As energias livres de ligação da diidrouracila e da 9H-purina à enzima foram de -8,29 e -8,01 kcal/mol, que correspondem a constantes de dissociação (Kd) de 8.3 x 10-7 e 1.6 x 10-6 mol/L, respectivamente. Ou seja, ambas as estruturas são bons ligantes da enzima modelada.
CONCLUSÕES: Este estudo demonstrou que tanto os metabólitos (diidrouracila, uracila, 9H-purina) produzidos por B. cereus e B. subtilis, quanto a enzima modelada (fosforibosiltransferase) a partir do genoma de M. incognita apresentam potencial para serem empregados no desenvolvimento de novos produtos para o controle de M. exigua.
AGRADECIMENTOS: CAPES, CNPq, FAPEMIG e CESUP-UFRGS, onde parte do trabalho foi desenvolvido.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: CAMPOS, V.P. AND SILVA, J.R.C. (2008). Management of Meloidogyne spp. in coffee plantations. In Plant parasitic nematodes of coffee. (Souza, R.M. ed), pp. 149-164. São Paulo: Springer.
CASTRO, J. M. C, CAMPOS V. P., POZZA, E. A., NAVES, R. L., ANDDRADE JÚNIOR, V. C., DUTRA, M. R., COIMBRA, J. L., MAXIMINIANO, C. AND SILVA, J. R. C. (2008). Levantamento de fitonematóides em cafezais do sul de Minas Gerais. Nematologia Brasileira, 32, 56-64.
CHITWOOD, D. J. (2002). Phytochemical based strategies for nematode control. Annu. Rev. Phytopathol., 40, 221-249.
CRONIN, D., MOËNNE-LOCCOZ, Y., FENTON, A., DUNNE, C., DOWLING, D. N. AND O’GARA, F. (1997). Role of 2,4-diacetylphloroglucinol in the interactions of the biocontrol pseudomonad strain F113 with the potato cyst nematode Globodera rostochiensis. Appl. Environ. Microb., 63, 1357–1361.
CUI, Q., SULEA, T., SCHRAG, J. D., MUNGER, C., HUNG, M.-N., NAÏM, M., CYGLER, M. AND PURISIMA, E. O. (2008). Molecular dynamics and solvated interaction energy studies of protein-protein interactions: the MP1-p14 scaffolding complex. J. Mol. Biol., 379, 787-802.
DIAS-ARIEIRA, C. R., FURLANETTO, C., SANTANA, S. M., BARIZÃO, D. A. O., RIBEIRO, R. C. F. (2010). Fitonematoides associados a frutíferas na região noroeste do Paraná, Brasil. Rev. Bras. Frutic., 32, 1064-1071.
LIU, L., BURNAM, L., SLUDER, A., LINK, E. AND WESTLAND, B. (2006). Screens and assays for agents useful in controlling parasitic nematodes. US Patent 7,064,243 B2, 20 June 2006.
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO - MAPA. Informe estatístico do café. (2012). Retrieved June 13, 2012, from http://www.agricultura.gov.br/vegetal/estatisticas.
