ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DA ENZIMA LIGNINA PEROXIDASE EM MEIO LÍQUIDO COM ÓLEO DIESEL 1% (v/v) POR FUNGOS FILAMENTOSOS COM POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
AUTORES: Silva, M.G.C. (UFPE) ; Almeida, D.G. (UFPE) ; Maciel, C.C.S.M. (UFPE) ; Miranda, R.C.M.M. (UFS) ; Gusmão, N.B.G. (UFPE)
RESUMO: Este trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade de sete fungos filamentosos, produtores de enzimas ligninolíticas, em sintetizar a enzima Lignina peroxidase(LiP) em presença de óleo diesel como fonte de carbono. Após o período de incubação,realizou-se a quantificação da atividade enzimática por espectrofotometria e a análise estatística feita pelo teste t de Student dos valores obtidos apresentou diferença estatística significativa entre as atividades da enzima para os fungos estudados. O fungo FDG08 apresentou o maior valor da atividade da enzima lignina peroxidase 2.132U/L, no entanto não apresentou diferenças significativas em relação ao fungo FDG 20 2.008U/L.Conclui-se que foi possível a síntese enzimática de Lignina peroxidase em presença de óleo diesel pelos fungos estudados.
PALAVRAS CHAVES: Fungos filamentosos; Lignina Peroxidase(LiP); Óleo diesel
INTRODUÇÃO: Acidentes em torno da cadeia produtiva do petróleo são apontados pela literatura como importantes fontes poluidoras.Os locais onde existem rotas de navegação estão constantemente sujeitos a acidentes envolvendo lançamentos de petróleo e derivados no mar (LE DRÉAU et al., 1997).Os óleos crus contêm muitas substâncias tóxicas como benzeno, tolueno, xileno, fenóis além de outras substâncias de baixo peso molecular (KENNISH, 1996). O óleo diesel, um derivado do petróleo, é constituído por uma complexa mistura de alcanos e compostos aromáticos sendo frequentemente relatado como contaminante do solo por vazamentos em tanques de armazenagem e gasodutos ou lançado em derrames acidentais (GALLEGO et al., 2001).
A enzima lignina peroxidase (LiP), usualmente isolada de fungos filamentosos de degradação branca (podridão branca ou clara) e de degradação parda (podridão parda), é uma glicoproteína hémica capaz de catalisar uma variedade de compostos fenólicos, não fenólicos, hidratos de carbono aromáticos, álcoois benzílicos e de metila e outros compostos que são resistentes ao ataque microbiano como também provoca rearranjos intramoleculares (DURÁN & ESPOSITO, 1997; SOARES, 2000). Deste modo, esta enzima pode ser aplicada em processos biotecnológicos para a biodegradação de hidrocarbonetos ou resíduos relacionados à lignina (MACIEL et al.; 2010; DURÁN & ESPOSITO, 1997). Portanto, o presente trabalho teve como objetivo detectar a habilidade de fungos filamentosos em produzir a enzima Lignina peroxidase em presença de óleo diesel como substrato.
MATERIAL E MÉTODOS: Fungos avaliados como produtores de lignina peroxidase foram testados quanto a sua capacidade de produzir a enzima utilizando o óleo diesel como substrato. Para isto, três discos de gelose (6mm de diâmetro) contendo micélio de fungo previamente crescido em meio de extrato de malte Agar (MEA), foram inoculados em frascos de Erlenmeyer contendo 50mL de solução de Manachini (MANACHINI et al., 1987), acrescido de 1% de óleo diesel cedido pela Petrobras-(Transporte S.A. – TRANSPETRO) e incubados durante 72 horas a 30°C ± 1 em condição estática. Após esse período, as amostras de cada frasco foram filtradas e com o extrato enzimático foi avaliada a atividade da lignina peroxidase (MACIEL et al ., 2010). A atividade da LiP foi determinada pela oxidação do álcool veratrílico onde a mistura reativa foi composta por 1mL de tampão tartarato de sódio 125mM pH3.0, 500 µL de álcool veratrílico 10mM, 500 µL de peroxido de hidrogênio 2mM e 500 µL de extrato enzimático. A reação foi iniciada pela adição de peroxido de hidrogênio e a aparência do aldeído veratrílico foi determinada a 310nm através do espectrofotômetro HP 8453 UV-visível.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Na figura 1 pode-se observar a produção de lignina peroxidase pelos sete fungos selecionados após 3 dias de incubação utilizando o óleo diesel como substrato. O fungo que demonstrou um maior potencial na produção da enzima em estudo foi o FDG 08 com atividade de 2.132U/L de enzima. Apesar de o substrato utilizado ser limitante,pode-se ainda observar uma produção considerável da enzima pelos fungos selecionados, sugerindo que os mesmos apresentam potencial enzimático ainda que em condições não ideais.Após análise estatística (figura 2) dos resultados da atividade da enzima Lignina Peroxidase pelos fungos selecionados, observou-se que há diferença estatística significativa entre o FDG8 e a maioria dos fungos testados com (p < 0,05), com exceção do FDG 20 que demonstrou um p (0,487970).Os hidrocarbonetos podem servir como fonte de carbono para o desenvolvimento de micro-organismos. No entanto há a necessidade de outros nutrientes, como o nitrogênio e o fósforo para a formação de sua biomassa. Há também demanda por micronutrientes, como enxofre, ferro, magnésio, cálcio e sódio. A disponibilidade desses elementos varia em diferentes ambientes e podem ser adicionados para estimular a biodegradação (ROSATO, 1997). Maciel e colaboradores em 2010, trabalhando com fungos filamentosos isolados de local impactado por petroderivados, obtiveram uma atividade máxima para a LiP de 144 U/L, utilizando óleo diesel como substrato indutor. Silva e colaboradores em 2007 ao estudar a capacidade de biodegradação de resíduos agrícolas por fungos Basidiomicetes pertencentes ao gênero Pleurotus sp. observou que a atividade máxima foi de 2,50 U/L em um período de 60 dias de incubação, concluindo que as linhagens apresentaram baixa atividade.
Figura 1.Atividade da Lignina peroxidase em presença de óleo diesel 1%
Atividade da Lignina Peroxidase para os fungos selecionados após 3 dias de incubação utilizando o óleo diesel como substrato
Figura 2. Análise estatística pelo teste t de Student para a atividade
Análise estatística pelo teste t de Student dos fungos selecionados para a produção da enzima Lignina Peroxidase em presença de óleo Diesel
CONCLUSÕES: Deste modo, no presente trabalho os resultados demonstraram que os fungos apresentaram a capacidade de produção da enzima em presença do óleo diesel sendo possível detectar a atividade da enzima Lignina Peroxidase nos extratos dos fungos pesquisados a valores relativamente altos se comparados com os da literatura, sugere-se também que os fungos em questão são promissores para produção desta enzima, contudo é importante um estudo mais detalhado para confirmar seu potencial biotecnológico.
AGRADECIMENTOS:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: AGUIAR FILHO, J. M. M. Análise enzimática de fungos lignocelulolíticos cultivados em vinhaça e bagaço de cana-de-açúcar. Dissertação de Mestrado. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2008.
DURÁN, N.; ESPOSITO, E. Biodegradação de lignina e tratamento de efluentes por fungos ligninolíticos. In: Melo, I.S.; Azevedo, J. L.; (Eds.). Microbiologia ambiental. Jaguariúna: Embrapa-CNPMA. Documentos. 11:.269-292, 1997.
GALLEGO, J.R., LOREDO, J., LLAMAs, J.F., VAZQUEZ, F., SANCHEz, J.,.Bioremediation of diesel-contaminated soils: evaluation of potential in situ techniques by study of bacterial degradation. Biodegradation 12, 325–335. 2001.
KENNISH, M.J. 1996. Practical handbook of estuarine and marine pollution. CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. P. 524.
LE DRÉAU, Y.; JACQUOT, F.; DOUMENQ, P.; GUILIANO, M.; BERTRAND, J.C.; MILLE, G.– Hydrocarbon balance of a site which had been highly and chronically contaminated by petroleum wastes of a refinery (from 1956 to 1992) – Marine Pollution Bulletin V.34, p.456 – 468, 1997.
MACIEL, C.C.S.; SOUZA, M.A.; GUSMÃO, N.B.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. Produção de enzimas do complexo lignolítico por fungos filamentosos isolados de locais impactados por petroderivados. Exacta. V.8, p. 299-305, 2010.
MANACHINI, P. L.; FORTINA, M. G.; PARINI, C. Purification and properties of an endopolygalacturonase produced by Rhizopus stolonifer. Biotechnology Letters. V.9, p. 219-224, 1987.
MIRANDA, R. C. M.; GOMES, E. B.; GOUVEIA, E. R.; MACHADO, K. M. G.; GUSMAO, N. B. Decolorization of laundry effluent by filamentous fungi. African Journal of Biotechnology. Vol. 11, p. 4216-4224, 2012.
MOREIRA NETO, S. L. Enzimas Lignolíticas produzidas por Psilocybe castanella CCB444 em solo contaminado com hexaclorobenzeno. Dissertação de mestrado. Instituto de Botânica da Secretaria de Estado do Meio Ambiente, São Paulo, 2006.
ROSATO, Y. B. Biodegradação do petróleo. apud MELO I. S & AZEVEDO, J. L. Microbiologia Ambiental. Jaguariúna. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. Cap.14, p: 307-334. 1997.
SOARES, G. M. B. Aplicação de Sistemas enzimáticos à degradação de corantes têxteis. Tese de Doutorado. Universidade do Minho, 2000.
