ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: PERFIL ELETROFORÉTICO DE Aeromonas spp. ISOLADAS DE PEIXES ORIUNDOS DO VALE DO SUBMÉDIO SÃO FRANCISCO.
AUTORES: Gonçalves, Y.S. (UNIVASF) ; Neri, A.O. (UNIVASF) ; Cruz, D.R.R. (UNIVASF) ; Costa, M.M. (UNIVASF) ; Felix, W.P. (UNIVASF)
RESUMO: As bactérias do gênero Aeromonas são importantes agentes de gastrenterites transmitidas aos seres humanos. Os principais fatores de virulência são: antígeno O, cápsulas, camada-S, exo e endotoxinas e sistema de secreção tipo III. Foram colhidas 66 amostras de peixes oriundos do vale do submédio São Francisco que após extração e quantificação das proteínas totais, foram aplicadas em um gel de SDS-PAGE. O perfil eletroforético mostrou a presença de bandas proteicas com massa molecular aparente entre 25 a 70 kDa, demonstrando a possível presença de proteínas responsáveis pela virulência.
PALAVRAS CHAVES: Aeromonas; Proteínas; Eletroforese
INTRODUÇÃO: A piscicultura é um tipo de exploração animal que vem se tornando cada vez mais importante como fonte de proteínas para o consumo humano. A maioria dos agentes etiológicos e seus efeitos patogênicos ainda não foram identificados e estudados devidamente. As bactérias do gênero Aeromonas são exemplo desses agentes que merecem ênfase (COSTA, 2003). São importantes agentes de gastrenterites transmitidas aos seres humanos pelo contato, consumo de carne e água contaminadas (ABDULLAH et al., 2003). As espécies patogênicas são: A. hydrophila, A. sobria e A. cavie (COSTA, 2003). O crescimento desses microrganismos são dependentes de vários fatores físicos e químicos como pH, temperatura e salinidade da água. As Aeromonas possuem diversos fatores de virulência que provocam patogenicidade. Os principais fatores de virulência são: antígeno O, cápsulas, camada-S, exo e endotoxinas e sistema de secreção tipo III (FIGUEIREDO e LEAL, 2008). A eletroforese é uma técnica que consiste na separação de biomoléculas através de um campo elétrico aplicado em um gel. O método SDS-PAGE é um dos tipos de eletroforese, no qual utiliza-se um detergente aniônico que se liga às proteínas, provocando o desdobramento das mesmas, tornando-as similares e com semelhante razão carga/massa, para promover uma separação através das massas moleculares nas proteínas analisadas (SILVA, 2002). Esse trabalho tem como objetivo caracterizar isolados de Aeromonas spp. de peixes oriundo do vale do submédio São Francisco quanto ao seu perfil eletroforético.
MATERIAL E MÉTODOS: Foram colhidas 66 amostras de peixes oriundos do Vale do Submédio São Francisco. A preparação das amostras de diferentes isolados para verificação da presença de diversidade de padrões proteicos totais foi realizada como descrito em Costa (2003). Após extração, as proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976). Em seguida, foram aplicadas em um gel de poliacrilamida com condições desnaturantes (SDS-PAGE) a 12% utilizando a técnica descrita por Laemmli (1970). Nessa metodologia os géis foram corados com Coomassie blue e/ou revelados com nitrato de prata (BLUM et al., 1987).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os dados preliminares da concentração de proteínas totais solúveis (µg.mL-1) nas 66 cepas estudadas de Aeromonas spp. foram divididas conforme a coloração apresentada, no meio de cultura, em 4 grupos: 50 cepas com coloração Bege (Figura 01) e 10 cepas com coloração Marrom, 3 cepas com coloração Amarela e 3 cepas com coloração Róseo (Figura 02). A técnica de SDS-PAGE é bastante utilizada na determinação de perfis proteicos de células bacterianas ou produtos extracelulares de patógenos importantes como Aeromonas e Escherichia coli (FIGUEIREDO e LEAL, 2008). A partir desses perfis, é possível comparar a diferença de estruturas antigênicas ou proteínas totais de grupos isolados ou de espécies (EWING et al., 1960). O perfil eletroforético apresentado pelas cepas testadas mostrou a presença de bandas proteicas com massa molecular aparente entre 25 e 70 kDa. Dados da literatura demonstram que as proteínas responsáveis pelos principais fatores de virulência (antígeno O, cápsulas, camada-S, exo e endotoxinas e sistema de secreção tipo III) encontram-se em torno dessa massa molecular aparente (POOBALANE et al., 2008; YEH and KLESIUS, 2011).
FIGURA 01
Concentração de proteínas totais solúveis (µg.mL-1) nas 50 cepas de Aeromonas spp com coloração Bege.
FIGURA 02
Concentração de proteínas totais solúveis (µg.mL-1) nas 10 cepas com coloração Marrom, 3 cepas com coloração Amarela e 3 cepas com coloração Róseo.
CONCLUSÕES: Nas cepas testadas possivelmente há a presença de proteínas responsáveis pela virulência, mas os estudos serão continuados no intuito de purificar essas proteínas e assim testar sua real capacidade de causar doenças em peixes e humanos.
AGRADECIMENTOS: CNPq, Facepe, Fapesb e Univasf.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: ABDULLAH, A. I.; HART, C. A.; WINSTANLEY, C. Molecular characterization and distribution of virulence associated genes among Aeromonas isolates from Libya. Journal of Applied Microbiology, v.95, p.1001-1007, 2003. BLUM, H.; BEIER, H.; GROSS, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Eletrophoresis, v. 8, p. 93 – 99, 1987. BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 722, p. 248 – 254, 1976. COSTA, A. B. Caracterização de bactérias do complexo Aeromonas isoladas de peixes de água doce e sua atividade patogênica. Tese. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – Universidade de São Paulo. Pós-graduação em Agronomia. 2003. EWING, W. H; DAVIN, B. R.; EDWARDS, P. R. The decarboxylase reactions of Enterobacteriaceae and their value in taxonomy. Public Health Laboratory, v. 18, p.77-83, 1960. FIGUEIREDO, H. C. P. e LEAL, C. A. G. Tecnologias aplicadas em sanidade de peixes. Revista Brasileira de Zootecnia, v.37, p. 08-14, 2008. LAEMMLI, U. K. Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v. 22, p. 680 – 685, 1970. POOBALANE, S.; THOMPSON, K. D.; DIAB, A.; ARDÓ, L.; JENEY, G.; ALEXANDRA ADAMS, A. Protein expression by Aeromonas hydrophila during growth in vitro and in vivo. Microbial Pathogenesis 45. 60–69. 2008. SILVA, C. L. S. P. Eletroforese bidimensional: Princípios e Aplicações. Revista Ciências Agrárias e da Saúde – Fundação Educacional de Andradina, v. 2, n. 1, p. 74-78, 2002. YEH, H. Y.; KLESIUS, P. H.; Over-expression, purification and immune response to Aeromonas hydrophila AL09-73 flafellar proteins. Fish & Shellfish Immunology. 31. 1278-1283. 2011.
