52º CBQ - Isolamento de Microrganismos do Solo da Agroindústria Sucroalcooleira Produtores de Enzimas e Polímeros de Interesse Biotecnológico.

ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia

TÍTULO: Isolamento de Microrganismos do Solo da Agroindústria Sucroalcooleira Produtores de Enzimas e Polímeros de Interesse Biotecnológico.

AUTORES: Padilha, I.Q.M. (UFPB) ; Grisi, T.C.S.L. (UFPB) ; Carvalho, L.C.T. (UFPB) ; Dias, P.V.S. (UFPB) ; Araújo, D.A.M. (UFPB)

RESUMO: A biodiversidade microbiana do solo é responsável pela produção de centenas de substâncias, como enzimas, polímeros e antibióticos. Este trabalho tem como objetivo geral o estudo de amostras de solo da Agroindústria Sucroalcooleira para prospecção de produtos biotecnológicos. Foram isoladas 55 bactérias em meio contendo CMC e em diferentes temperaturas. Os resultados mostram que os microrganismos produtores pertencem aos gêneros Bacillus (CMCase/Xilanase/Amilase/Protease), Exiguobacterium (Amilase/Protease), Paenibacillus (EPS), Klebsiella (EPS), Pseudomonas (PHB), Agrobacterium (EPS) e Stenotrophomonas (Amilase/Protease/EPS). Os resultados demonstram o alto potencial biotecnológico dos microrganismos, baseado no uso sustentado da biodiversidade e dos seus recursos derivados.

PALAVRAS CHAVES: Solo; Microrganismos; Enzimas/polímeros

INTRODUÇÃO: O solo é um habitat bastante peculiar com relação a outros habitats terrestres devido à sua natureza heterogênea complexa e dinâmica. A biota do solo inclui representantes de todos os grupos de microrganismos (bactérias, fungos, algas). A presença de um microrganismo específico em determinado solo é função das condições ambientais dominadas e dos limites de sua bagagem genética. Algumas espécies de microrganismos podem sobreviver em condições extremas de salinidade, temperatura, pressão e pH. Além disso, os microrganismos, de modo geral, são bastante versáteis em adaptar-se a mudanças ambientais. Limitações físicas (umidade, aeração, porosidade) e químicas (disponibilidade de nutrientes e toxicidade de elementos como metais pesados) podem ocorrer nos solos, porém muitas espécies são capazes de se adaptar a essas condições (MOREIRA; SIQUEIRA, 2002). A biodiversidade microbiana do solo é responsável pela descoberta de centenas de substâncias como enzimas, antibióticos, entre outras. (LORENZ e JÜRGEN, 2005). Está se descobrindo cada vez mais funções gênicas, particularmente, para propósitos industriais. Este fato indica que a utilização de biotecnologia constitui uma opção viável e uma ferramenta fundamental para o uso sustentável e agregação de valor. A prospecção de enzimas e polímeros a partir da identificação de novas cepas pode contribuir significativamente para a descoberta de novos produtos biotecnológicos. Dessa forma, este trabalho tem como objetivo isolar bactérias mesofílicas e termofílicas presentes no solo cultivado quanto à produção de enzimas (amilases, celulases e proteases) e polímeros (polihidroxibutirato e exopolissacarideo), tal como realizar a identificação molecular das bactérias produtoras pelo estudo do gene 16S rDNA.

MATERIAL E MÉTODOS: Área de Estudo, Coleta e Análise de Amostras de Solo: as amostras de solo foram coletadas na Usina Japungu Agroindustrial S.A, localizada em Santa Rita – PB, de acordo com o método simples (EMBRAPA, 1999). Isolamento das Bactérias: 25 g do solo foi adicionado a 225 mL de solução de Ringer. Foram realizadas demais diluições As placas foram incubadas a 37º e 55 °C, após 24-48 h, as colônias bacterianas foram repicadas para um tubo estoque. Amplificação do gene 16S rRNA e Sequenciamento: a extração de DNA genômico das linhagens foi realizada com o AxyPrep Bact .Gen. DNA Kit (Axygen Bioscience). Os genes 16S rRNA foram amplificados utilizando os seguintes primers universais: 27F e 1525R. Para a PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), foi utilizado kit de PCR Master MIX (Promega, Madison, USA). As amostras foram seqüenciadas em seqüenciador automático, ABI 3100 (Applied Biosystems). Análises das seqüências: as sequências selecionadas foram comparadas ao banco de sequências não redundantes do GenBank usando-se BLASTn. Árvores filogenéticas foram geradas com o software MEGA5.0. Atividade Enzimátia: os isolados foram inoculados diferentes meio contendo leite em pó desnatado, amido, CMC e xilano. Após período de 3 dias a 37º C, observou-se a presença de halos claros de degradação ao redor das colônias. Índice Enzimático (IE): foi avaliado de acordo com HANKIN e ANAGNOSTAKIS (1975), determinado pela medida do diâmetro do halo de degradação dividido pelo diâmetro da colônia (mm). Produção PHB (polihidroxibutirato) e EPS (exopolisacarídeos): os isolados foram cultivados em meio mínimo desbalanceado (MMD) com sacarose. A produção de PHB foi verificada após cinco dias de incubação a 37° C, pela intensidade da coloração por Sudan Black (SB) do crescimento bacteriano.

RESULTADOS E DISCUSSÃO: A partir do solo de cultivo de cana de açúcar e da torta de filtro, foram isoladas 55 bactérias em meio contendo CMC e em diferentes temperaturas (37ºC e 55ºC). Destas, 22 isolados apresentaram alguma atividade enzimática extracelular (Figura 1). Foram isoladas 23 cepas em meio MMD-sacarose, sendo que 5 isolados produziram PHB e 7 isolados produziram EPS. Os resultados mostram que os microrganismos produtores pertencem aos gêneros Bacillus (CMCase/Xilanase/Amilase/Protease), Exiguobacterium (Amilase/Protease), Paenibacillus (EPS), Klebsiella (EPS), Pseudomonas (PHB), Agrobacterium (EPS) e Stenotrophomonas (Amilase/Protease/EPS) (Figura 2). O gênero Bacillus é conhecido por produzir uma variedade de enzimas extracelulares (HAGIHARA et al., 2001; SETYORINI et al., 2006). Além disso, linhagens de Stenotrophomonas maltophilia produtoras de amilases foram isoladas de diferentes habitats (solo e água) (JACOBI et al.,1996). A presença de EPS em Pseudomonas aeruginosa tem sido estudada por Celik e colaboradores (2007), e em Streptococcus mutans por Vimala e Lalithakumari (2003). Vários trabalhos relatam a produção de EPS por Bacillus sp. (CORSARO et al. 1999; LARPIN et al. 2002), embora apenas poucas descrições sobre a produção de EPS por espécies do gênero to Paenibacillus (PRADO-ACOSTA et al. 2005). Este gênero tem produzido EPS de alta viscosidade com propriedades pseudoplásticas superiores. Outras espécies do gênero Pseudomonas e Agrobacterium (TRIVENI et al., 2001) também mostraram capacidade de produzir EPS com diferentes propriedades. Diversos microrganismos são conhecidos pela capacidade de acumular PHA em altas concentrações (STEINBUCHEL e FUCHTENBUSH, 1998), incluindo Ralstonia eutropha e várias espécies de Pseudomonas (REN et al., 2005; SLATER et al., 1998).

Figura 1

Atividade CMCase em "A"; Atividade amilolítica em "B"; Atividade proteolítica "C". Produção de PHB em "D" e produção de EPS "E".

Figura 2

Árvore filogenética baseada nas sequências do gene 16S rDNA dos linhagens isolados do solo com sequências conhecidas do GenBank.

CONCLUSÕES: Os resultados demonstram o alto potencial biotecnológico dos microrganismos isolados como produtores de enzimas e biopolímeros, baseado no uso sustentado da biodiversidade e dos seus recursos derivados, agregando valor para os diferentes setores produtivos.

AGRADECIMENTOS: RENORBIO; suporte financeiro do CNPq/CAPES e o auxílio técnico do Dr. Breno Grisi, Dra. Krystyna Lira (UFPB)e Dante Guimarães da Japungu Agroindustrial S/A.

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