52º CBQ - Estudos preliminares sobre as proteínas dos nematocistos da medusa Catostylus tagi

ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia

TÍTULO: Estudos preliminares sobre as proteínas dos nematocistos da medusa Catostylus tagi

AUTORES: Morais, Z. (EGAS MONIZ COOPERATIVA DE ENSINO SUPERIOR) ; Mascarenhas, P. (EGAS MONIZ COOPERATIVA DE ENSINO SUPERIOR) ; Soeiro, R. (EGAS MONIZ COOPERATIVA DE ENSINO SUPERIOR) ; Parracho, T. (EGAS MONIZ COOPERATIVA DE ENSINO SUPERIOR) ; Nogueira, I. (INSTITUTO SUPERIOR TECNICO - UTL) ; Guitian, E. (UNIVERSIDADE SANTIAGO DE COMPOSTELA)

RESUMO: A medusa Catostylus tagi ocorre abundantemente no verão nos estuários dos rios Sado e Tejo, sudoeste de Portugal. O seu sistema de ataque e defesa localiza-se sobretudo nos nematocistos e consiste, principalmente, de proteínas e péptidos. Neste trabalho isolaram-se os nematocistos intactos, a partir dos braços do animal, e a seguir romperam-se as cápsulas, por sonicação e ultracentrifugação, libertando os seus constituintes. Após a dessalinização, por diálise, e concentração, por liofilização, realizou-se uma eletroforese bidimensional que revelou oito proteínas com potencial interesse, todas não-glicosiladas. Caracterizaram-se as proteínas por espectrometria de massa MSMS Maldi-Tof/Tof. A comparação com as bases de dados indicou a presença de uma proteína de choque térmico, HSP70.

PALAVRAS CHAVES: Catostylus tagi ; nematocistos; proteinas péptidos

INTRODUÇÃO: Uma vez constatada a aparente inevitabilidade das rápidas mudanças climáticas, importa investigar os seus efeitos na vida do planeta. No caso dos seres gelatinosos marinhos, o sentido atual das alterações climáticas parece favorecer a sua reprodução e distribuição (LYNAM et al., 2006). As medusas, popularmente conhecidas como alforrecas ou águas-vivas, são seres gelatinosos do phylo Cnidária. A medusa Catostylus tagi encontra-se distribuída ao longo da costa oeste e atlântica da Europa. A umbela de cor esbranquiçada pode atingir 50 cm de diâmetro; os quatro pilares inter-radiais dividem-se em oito braços que apresentam numerosas excrescências (SALDANHA, 1995). A C. tagi, único exemplar do género Catostylus na Europa, tem uma composição geral semelhante à de outras medusas edíveis. Num estudo anteriormente realizado, verificaram-se diferenças significativas entre a umbela e os braços (oral arms), no que respeita às proteínas e gorduras totais, havendo uma maior concentração em proteínas e gorduras totais nos braços do que na umbela (MORAIS et al., 2009). O colagênio da umbela da C. tagi foi já caracterizado, tendo-se verificado proximidade aos tipos V e XI (CALEJO et al., 2009). No presente estudo, objetivou-se a caracterização das proteínas dos braços, em especial as presentes nos nematocistos.

MATERIAL E MÉTODOS: A captura dos animais realizou-se em setembro de 2011, no estuário do rio Tejo, Portugal. Os braços foram removidos e tratados segundo XIAO et al. (2010). No laboratório, adotou-se o procedimento descrito por WIEBRING et al. (2010), para a abertura dos nematocistos. A dessalinização da mistura foi efetuada por diálise, na presença de inibidores de protease (Halt®). O produto liofilizado foi redissolvido em tampão de focagem isoelétrica e procedeu-se à separação a pH 4-7, com voltagem máxima de 3,5 kV. Antes da segunda eletroforese, a tira (strip) foi equilibrada com ditiotreitol e iodoacetamida. A eletroforese SDS-PAGE realizou-se em gel a 15%. A pesquisa de proteínas glicosiladas fez-se por tratamento do gel com ácido periódico e com o corante específico pro-Q Emerald 300. A imagem electroforética para deteção genérica das proteínas obteve-se recorrendo ao corante SYPRO Ruby. Para facilitar o corte das manchas de interesse corou-se com Coomassie coloidal. As manchas cortadas foram descoradas com uma mistura de NaHCO3/CH3CN, 1:1, e armazenadas em água tipo I. A caracterização das proteínas foi ensaiada por digestão tríptica seguida de PMF (peptide mass fingerprint) em MALDI TOF e por espectro MSMS MALDI-TOF/TOF (ULTRAFLEX III TOF/TOF BRUKER). Atualmente decorrem mais ensaios por nano-cromatografía líquida acoplada a electrospray. O estudo incluiu também reações histoquímicas para a pesquisa de metais que poderiam integrar possíveis complexos metaloproteicos, nomeadamente os testes da orceína (HENWOOD, 2003) e de Von Kossa (HAYAT, 1993). A caracterização externa dos nematocistos foi obtida por microscopia eletrônica de varredura (SEM) num equipamento Hitachi S-2400/Bruker, segundo FENG et al. (2010).

RESULTADOS E DISCUSSÃO: As colorações histológicas utilizadas forneceram resultado negativo para cobre, na concentração detetável pelo método, e positivo para cálcio. No caso do cálcio, os ensaios não permitiram concluir a sua localização exata, podendo situar-se na membrana mais interna ou na mais externa, além de várias zonas do interior do nematocisto. Estudos sobre outros metais estão presentemente a decorrer. As imagens da microscopia eletrônica da C. tagi mostraram nematocistos de vários tamanhos sendo 10 µm o comprimento médio da parte mais alongada, como mostra a figura 1. Uma vez aberta a cápsula, a “corda/fio” desenrola-se no exterior atingindo comprimentos até dez vezes maiores que o da cápsula que a contém, figura 2. Quanto à composição proteica dos nematocistos, a electroforese bidimensional revelou 8 manchas, na gama de massas entre 35 e 60 kDa. Dentre as proteínas isoladas, encontrou-se, pelos estudos de espectrometria de massas, um score de 81,1 para a «heat shock protein 70» ou proteína de choque térmico, HSP70, a qual foi já referida na anthozoa Stylophora pistillata (TOM et al. 1999; http://www.uniprot.org/uniprot/Q9U777) e na scyphozoa Aurelia aurita (SCHROTH et al, 2005). Um estudo recente propõe que a HSP70 pode ser utilizada no estudo da tolerância dos organismos às mudanças climáticas (BEDULINA et al, 2010).

Figura 1

Foto de SEM de um nematocisto fechado, obtido dos braços de Catostylus tagi.

Figura 2

Foto de SEM de um nematocisto aberto, obtido dos braços de Catostylus tagi.

CONCLUSÕES: As propriedades gerais das HSP760 descritas na literatura, permitem supor que, nos nematocistos da C. tagi, esta chaperona contribui para que o fio/corda esteja enovelado (figura 1) ou desenovelado (figura 2), consoante a situação de stress. A caracterização das outras proteínas isoladas está agora a decorrer.

AGRADECIMENTOS: Este trabalho foi financiado pela Egas Moniz Cooperativa de Ensino Superior crl, projeto EM – ZM – 03/04.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BEDULINA, D.S.; ZIMMER, M.; TIMOFEYEV, M.A. 2010. Sub-littoral and supra-littoral amphipods respond differently to acute termal stress. Comparative Biochemistry and Physiology, Part B, 155:413-418.

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FENG, J.; YU, H.; LI, C.; XING, R.; LIU, S.; WANG, L.; CAI, S.; LI, P. 2010. Isolation and characterization of lethal proteins in nematocyst venom of the jellyfish Cyanea nozakii Kishinouye. Toxicon, 55:118-125.

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TOM, M.; DOUEK, J.; YANKELEVICH, I.; BOSCH, T.C.; RINKEVICH, B. 1999. Molecular characterization of the first heat shock protein 70 from a reef coral. Biochem. Biophys. Res. Commun. 262:103-108.

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XIAO, L.; ZHANG, J.; WANG, Q.Q.; HE, Q.; LIU, S.; LI, Y.; ZHANG, L. 2010. In vitro and in vivo haemolytic studies of tentacle-only extract from Cyanea capillata. Toxicology in Vitro, 24:1203-1207.