ÁREA: Produtos Naturais
TÍTULO: DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICO DA RAIZ DA Cassia grandis Linn. (FABACEAE)
AUTORES: SANTOS, S. M. (UFPE) ; MACHADO, L. P. (UFPE) ; AQUINO,V. C. L. (UFPE) ; COSTA, R. V. (UFPE) ; SILVA, T. G. (UFPE) ; ALBUQUERQUE, J. F. C. A. (UFPE)
RESUMO: Cassia grandis pertence à família Fabaceae. É uma árvore de grande porte apresentando crescimento rápido. È utilizada largamente em paisagismo urbano devido ao caráter ornamental de sua bela floração rosa, possui folhas pequenas e caducas. A cassia grandis é utilizada na medicina popular em tratamentos de doenças gastrointestinais e na cura de úlceras. A raíz da cassia foi extraida com etanol, seca em rotaevaporador e encaminhada para avaliação da atividades citotoxica. Para esse teste foram utilizadas três tipos de células de linhagens tumorais, HT29 (carcinoma de cólon-humano), HEp-2 (carcinoma de laringe) e NCI H-292 (câncer de pulmão– humano). Das três linhagens tumorais testadas com o extrato etanólico, somente a linhagem HEp2 apresentou citotoxicidade considerada apenas moderada
PALAVRAS CHAVES: cassia grandis; atividade citotóxica; cássia rosa
INTRODUÇÃO: As plantas medicinais vêm sendo usadas tradicionalmente na cura de várias doenças desde os primórdios. Suas aplicações atuam em diferentes enfermidades desde o combate ao câncer até doenças patogênicas por microorganismos (Silvia, 2004; Calixto, 2000). De modo geral as plantas medicinais além de serem usadas com fins terapêuticos contribuem também na obtenção de novos medicamentos (Cechinel Filho, 1998). Com base na importância destas plantas foi realizada a análise da espécie Cassia grandis pertencente à família Fabaceae. Trata-se de uma árvore de grande porte que apresenta crescimento rápido. É utilizada largamente em paisagismos urbanos devido ao caráter ornamental de sua floração possui folhas pequenas e caducas. Os frutos do tipo vagem aparecem em novembro e dezembro e podem chegar a pesar um quilo em alguns casos. Conhecida popularmente como cássia-rosa ou cássia-gigante (LORENZI, 1992). Em lugares como a Tailândia as folhas da Cassia grandis são empregadas no tratamento de gastrite e úlcera e para combater à bactéria Gram-negativa Helicobacter pilori (HP) geradora do câncer gástrico e tem minimizado de forma significa esse tipo de tumor(KASHIWADA et al, 1998). Com base nestas informações, foi despertado o interesse em verificar a citoxicidade in vitro dessa planta em três linhagens de células tumorais. As linhagens das células utilizadas foram HT29 (carcinoma de cólon-humano), HEp-2 (carcinoma de laringe) e NCI H-292 (câncer de pulmão-humano) obtidas do Banco de células do Rio de Janeiro.
MATERIAL E MÉTODOS: As folhas da Cassia grandis foram coletadas nos jardins do edifício Residências da Jaqueira em Recife-Pe. O material coletado foi acondicionado em saco de algodão, foi seco à temperatura ambiente, protegido de sol, chuva e predadores, em seguida pesado e extraído três vezes consecutivas com etanol. O solvente foi evaporado e o extrato foi seco e pesado. Foram retiradas 0,0005g para serem submetidas aos testes para a verificações de atividade citotóxica. Análise de citotoxicidade pelo método do MTT vem sendo utilizada no programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), que testa mais de 10.000 amostras a cada ano (SKEHAN et al., 1990). É conhecido como um método rápido, sensível e barato. Foi descrito primeiramente por Mosman (1983), tendo a capacidade de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma análise colorimétrica baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação (BERRIDGE et al., 1996). Para o desenvolvimento dessa experiência as células foram plaqueadas na concentração de 1 x 105 células/mL. As substâncias previamente dissolvidas em DMSO foram diluídas em série no meio RPMI para obtenção das concentrações finais e adicionadas em placa de 96 poços (100 μL/ poço). As placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO2 a 37 C. Em seguida, foram adicionados 25 L da solução de MTT (sal de tetrazolium),e estas incubadas por três horas. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com DMSO puro em espectrofotômetro.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: O extrato etanólico total das raízes da Cassia grandis Linn. foi seco em evaporador rotatório em seguida foi colocado em dessecador à vácuo por um dia, para certificação que o material encontrava-se completamente seco. Em seguida foi pesado rendendo a quantidade de 125g, em relação ao material inicial seco. Isto correspondeu às três extrações consecutivas até esgotamento de quase totalidade dos componentes químicos existentes nas raízes. Desse material foram pesadas 0,0005g e enviadas ao laboratório de Farmacologia Experimental para serem testada nas células tumorais, isto é, para determinar a atividade citotóxica. Para este teste foram realizados experimentos em concentrações diferentes e observado o índice de inibição citotóxica de cada um deles. A leitura do resultado experimental em cada concentração foram analisados segundo suas médias e respectivos desvio no programa GraphPad Prism. Para maior segurança dos resultados cada amostra foi testada em duplicata. Uma escala de intensidade foi utilizada para avaliar o potencial citotóxico das amostras testadas. Amostras sem atividade (1 a 20% de inibição) com pouca atividade (inibição de crescimento celular variando de 20 a 50%), com atividade moderada (inibição de crescimento celular variando de 50 a 70%) e com muita atividade (inibição de crescimento variando de 70 a 100%). Os resultados desse estudo em relação ao percentual de inibição do crescimento celular (IC%) das amostras em três linhagens tumorais testadas na dose única de 50µg/mL estão apresentados a seguir. A célula HT29 apresentou índice de inibição de 29,65 com desvio de 0,8. A célula NCI-H292 apresentou índice de 9,5, e desvio de 2,7. A célula HEp-2, apresentou o melhor resultado entre todas descritos com os números 62,8% de inibição e 1,8% de desvio.
CONCLUSÕES: Para esse teste foram utilizadas três tipos de células de linhagens tumorais, HT-29 (carcinoma de cólon-humano), HEp-2 (carcinoma de laringe) e NCI H-292 (câncer de pulmão - humano). Estas células tumorais foram submetidas ao tratamento com extrato etanólico da raiz de Cassia grandis, somente a linhagem HEp-2 apresentou citotoxicidade moderada. Foi calculado o desvio padrão para cada linhagem de células utilizadas e observado cuidadosamente seus resultados com as respectivas percentagens. As três linhagens de células tumorais foram testadas na dose única de 50 µg/mL. A leitura deu-se a 595 nm.
AGRADECIMENTOS: Aos Laboratórios de Produtos Naturais e Sintéticos (LPNF) e de Cancerologia Experimental do Departamento de Antibióticos da UFPE pela realização desse trabalho.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BAUER, A. W.; Kirby, W. M. M.; SHEVIS, J. C.; TURCK, M. 1966. Antibiotic susceptibily testing by a standardized single disc method. Amer. J. Clin. Pathol., 45, 493-496,1998.
BERRIDGE, M. V.; TAN, A. S.; MCCOY, K. D.; WANG, R. The Biochemical and Cellular Basis of Cell Proliferation Assays that Use Tetrazolium Salts. Biochemica, 4: 14-19,1996.
CALIXTO, J. B. Efficacy, safety, quality control, marketing and regulatory guidelines for herbal medicines (phytotherapeutic agents).Brazilian Journal and Biological Research. 33: 179-189, 2000.
CECHINEL FILHO. Estratégias para a obtenção de compostos farmacologicamente ativos a partir de plantas medicinais. Conceitos sobre modificação estrutural para otimização da atividade, Química Nova; 21: 1, 1998.
KASHIWADA Y; WANG H. K.; NAGAO T.; KITANACA S.; YASUDA I.; FUGIOCA T.; YAMAGISHI T.; COSENTINO, L. M.; KOSUKA, M.; OKABE K.; IKHESHIRO Y.; HU C. K.; YEH, E.; LEE, K. H. Journal of Natural Products. 61: 9, 1090-1095, 1998.
LORENZI, H. Árvores Brasileiras, São Paulo, Ed. Plantarum, 1: 440, 1992.
MOSSMAN, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods, 65: 55-63, 1983.
SILVA, M. C.; CARVALHO, J. C. T. Plantas Medicinais: In: J. C. T. Carvalho, Fitoterápicos. Antiinflamatórios. Aspectos químicos, farmacológicos e aplicações terapêuticas. Ribeirão Preto, SP, Tecmedd. 424-480, 1988.
SKEHAN, P.; STORENG, R.; SCUDIERO, D.; MONKS, A; MCMAHON, J.; VISTICA, D.; WARREN, J.T.; BODESCH, H.; KENNEY, S.; BOYD, M. R. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer – drug screening. J. Natl. Cancer Inst. 82, 13: 1107-1112, 1990.
