ÁREA: Produtos Naturais
TÍTULO: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTICOLINESTERÁSICA E TOXICIDADE AGUDA DA Lippia hirta
AUTORES: OLIVEIRA, A. S. DE (UFSC) ; CAVALCANTE, I. D. (UFSC) ; BRIGHENTE, I.M.C. (UFSC)
RESUMO: RESUMO: Atualmente há uma busca intensa para pesquisa de novos inibidores enzimáticos em extratos de plantas, com especial interesse no isolamento e na identificação de novos inibidores da acetilcolinesterase, que constituem a principal forma de tratamento da doença de Alzheimer. O presente trabalho descreve os resultados da atividade anticolinesterásica e da toxicidade frente a Artemia salina para o extrato hidroalcoólico e para as frações de Lippia hirta. No extrato bruto e na maioria das frações observou-se atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase e baixa ou nenhuma toxicidade frente a Artemia salina que incentivam novos trabalhos de fracionamento e isolamentos dos possíveis compostos responsáveis pela atividade encontrada.
PALAVRAS CHAVES: lippia hirta, anticolinesterásicos, artemia salina.
INTRODUÇÃO: INTRODUÇÃO: O gênero Lippia (Verbenaceae) compreende aproximadamente 200 espécies de ervas, arbustos e pequenas árvores distribuídas pelos países da América do Sul, América Central e África (TERBLANCHÉ & KORNELIUS, 1996). O destaque para este gênero vegetal é a produção de óleo essencial pelas folhas a exemplo de Lippia alba (erva-cidreira) para os quais os componentes majoritários são g-terpineno, citral, b-cariofileno elinalol (SILVA et al, 2006). Um outro destaque neste gênero é Lippia sidoides, conhecida por "Alecrim Pimenta" no sertão nordestino utilizada na medicina popular como analgésico, antiséptico e anti-inflamatório nas afecções da boca e garganta.
Em geral, as plantas pertencentes ao gênero Lippia são empregadas no tratamento de distúrbios gastrointestinais e respiratórios e também utilizados como temperos. As principais classes de compostos encontradas em espécies do gênero Lippia são os monoterpenos oxigenados e sesquiterpenos.
A espécie Lippia hirta não tem sido documentada na literatura, o que incentiva novos estudos, uma vez que há uma grande biodinamicidade para o gênero. Neste trabalho foi investigada a toxicidade frente a Artemia salina para o extrato bruto hidroalcóolico e frações tais como, fração insolúvel (resina), hexânica, acetato de etila, butanólica e aquosa. Este é um método rápido e simples que dá informações valiosas a respeito da toxicidade e que engendra um amplo espectro de atividades biológicas. Além do teste de toxicidade, foi investigado o potencial anticolinesterásico, uma vez que fármacos anticolinesterásicos são requeridos no tratamento de doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, cujo tratamento colinérgico tem como alternativa clínica de maior eficácia o uso clínico de inibidores da acetilcolinesterase.
MATERIAL E MÉTODOS: MATERIAL E MÉTODOS: Após a coleta as partes aéreas da espécie, foram secas em estufa e maceradas com etanol 96%. O extrato bruto hidroalcoólico foi reduzido à secura pela evaporação do etanol e suspenso em metanol 20%. Após armazenado em geladeira por 24h, o extato foi filtrado para a obtenção do material insolúvel (resina). O filtrado obtido desta etapa foi então particionado com solventes de distintas polaridades: i) hexano (Hex), ii) acetato de etila (AcOEt) e iii) butanol.
Para o teste de toxicidade frente a A. salina as amostras foram diluídas em diferentes concentrações (100 – 1000 ug/mL) e colocadas na presença das larvas deste microcrustáceo. A mortalidade das mesmas foi observada após 24 horas de exposição. As análises foram feitas em triplicata. O resultado foi expresso, como a dose necessária para matar 50% das larvas DL50, obtido através do gráfico da % de animais sobreviventes em função do logarítmo da dose testada, com um intervalo de confiança de 95%.
O bioensaio de inibição da acetilcolinesterase foi realizado conforme MATA e colaboradores (2007) com modificações. Em uma cubeta colocou-se tampão Tris-HCl 50 mM pH=8, a amostra vegetal (0,1 mg/mL), e a enzima acetilcolinesterase (do peixe elétrico tipo VI-S, pó liofilizado, Sigma). Após 15 min a temperatura ambiente adicionou-se nesta cubeta de iodeto de acetiltiocolina, e o reagente de Ellman. Após 30 min fez-se a leitura em epectrofotômetro UV-VIS a 405 nm. Como controle positivo usou-se a galantamina (0,01 mg/mL) e como controle negativo utilizou-se o mesmo solvente em que foi dissolvida a amostra vegetal, onde a atividade enzimática foi considerada 100%. Na referência (ou branco) foram utilizados todos os reagentes exceto a enzima.
O resultado foi expresso em termos de % de inibição.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: RESULTADOS E DISCUSSÃO: O ensaio para a detecção de compostos que inibam a atividade da enzima acetilcolinesterase é baseado na medida da produção de tiocolina, quando o substrato acetiltiocolina é hidrolisado pela enzima acetilcolinesterase (AChE). Esta reação é acompanhada pelo aparecimento de uma coloração amarela medida a 405 nm devido ao ânion 5-tio-2-nitrobenzoato obtido da reação do reagente de Ellman (ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzóico) com a tiocolina.
Os extratos vegetais testados na concentração de 0,1 ug/mL que apresentam porcentagens de inibição maiores do que 50%, têm seu potencial anticolinesterásico descrito como alto e porcentagens de inibição entre 50 a 15% são descritos como de atividade baixa a moderada (ADSERSEN et al, 2006). Neste sentido, as amostras vegetais que exibirem valores de inibição maior ou igual a 50 % serão utilizadas para investigação da concentração inibitória (IC50). Então, quanto menor o valor de IC50, maior ação inibitória da enzima acetilcolinesterase in vitro.
Na Tabela 1 observa-se que o extrato bruto e a maioria das frações apresentaram valores de inibição maiores que 50 %, sendo que o extrato bruto e a resina apresentaram as melhores atividades com valor de IC50 de 43,2 e 42,6 ug/mL respectivamente. Além disto, podemos observar também na Tabela 1 que apenas o extrato bruto apresentou toxicidade frente a Artemia salina. As frações obtidas do extrato bruto não apresentaram toxicidade. Valores de DL50 superiores a 1000 ppm são considerados isentos de toxicidade. Estes valores obtidos por ambos os testes encorajam novas pesquisas, uma vez que foi verificada nas frações de Lippia hirta uma atividade de inibição da aceticolinesterase associada a uma baixa toxicidade o que é importante na procura de novos fármacos.
CONCLUSÕES: CONCLUSÕES: A baixa toxicidade para o extrato bruto e frações avaliada pelo teste com a A. salina, aliada aos baixos valores de IC50 para a atividade anticolinesterásica, sugerem que o fracionamento bio-guiado é uma ferramenta importante na tentativa de isolar princípios ativos com a atividade de interesse. Além disto, os futuros compostos isolados a partir de Lippia hirta podem tornar-se potenciais candidatos a fármacos com ação anticolinesterásica desejável ao tratamento de diversas patologias ligadas ao sistema colinérgico como a Doença de Alzheimer.
AGRADECIMENTOS: AGRADECIMENTOS: CAPES, CNPQ, UFSC.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: ADSERSEN, A; GAUGUIN, B; GUDIKSEN, L; JAGER, AK. 2006. Screening of plants used in Danish folk medicine to treat memory dysfunction for acetylcholinesterase inhibitory activity. J Ethnopharmacol 104: 418-422.
MATA, A.T.; PROENÇA, C.; FERREIRA, A.R.; SERRALHEIRO, M.L.M.; NOGUEIRA, J.M.F.; ARAÚJO, M.E.M.. 2007 Antioxidant and Antiacetylcholinesterase Activities of Five Plants Used as Portuguese Food Spices Food Chemistry, 103, 778-786.
SILVA, N.A.; OLIVEIRA, F.F. ; COSTA, L. C. B.; BIZZO, H.R.; OLIVEIRA, R.A. 2006. Caracterização química do óleo essencial da erva cidreira (Lippia alba (Mill.) N. E. Br.) cultivada em Ilhéus na Bahia. Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.8, n.3, p.52-55.
TERBLANCHÉ, F.C.; KORNELIUS,G. 1996. Essential oil constituents of the genus Lippia (Verbenaceae )- A literature review. J Essent Oil Res 8: 471-485.
