ÁREA: Química Analítica
TÍTULO: DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO ANALÍTICO PARA QUANTIFICAÇÃO DOS PERTURBADORES ENDÓCRINOS ETINILESTRADIOL E BISFENOL-A EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS
AUTORES: SILVA, L. G. A. (UFMA) ; BRITO, N. M. (IFMA) ; AMARANTE, O. P. J. (IFMA)
RESUMO: Substâncias conhecidas como perturbadores endócrinos,tem a capacidade de desregular o funcionamento do sistema endócrino de diversos organismos,alterando as funções normais do sistema imunológico ou nervoso.Dentre essas substâncias, destacam-se o monômero Bisfenol-A e o hormônio sintético Etinilestradiol pelo vasto uso na indústria e, consequentemente,a exposição humana e de diversos animais.Este trabalho,desenvolve um método analítico para determinação dos mesmos em organismos de sapos da espécie Physalaemus Cuvieri.Utilizando como método, extração por Dispersão em Fase Sólida com determinação por HPLC acoplado à detector Fluorescência,onde a recuperação ficou entre 56-65%, aceitável, considerando a complexidade da amostra (Ribani, 2004).
PALAVRAS CHAVES: physalaemus cuvieri, hplc, dispersão em fase sólida
INTRODUÇÃO: A queda na população de anfíbios em diversas lugares nos últimos anos trás a tona variadas discussões à respeito de despejo de compostos químicos no ambiente,é certo que outras causas têm sido sugeridas para explicar esse declínio, contudo, ressalta-se que a poluição ambiental tem sido a principal causa de problemas como anomalias sexuais e má formações em geral (MANN et al., 2009).Perturbadores endócrinos é uma classe de compostos com a capacidade de afetar o sistema endócrino, alterando todo o funcionamento do organismo.São persistentes no ambiente e facilmente transportados a longas distâncias pela atmosfera de suas fontes acumulando-se no solo e no sedimento de rios (MEYER, 1999).Dentre eles,o hormônios sintéticos,o 17-Etinilestradiol(EE2) e o monômero do plásticos Bisfenol-A(BPA),aqui estudados.O EE2 utilizado pelas mulheres para terapia de reposição de hormônio e método contraceptivo,desperta preocupação pela grande quantidade introduzida no ambiente e o BPA por ter um alto volume de produção,utilizado principalmente para fabricação de plásticos policarbonatos onde extenso uso do BPA na fabricação de produtos de consumo resulta em uma generalizada exposição humana e animal(YE et al, 2010).Visto toda a problemática,este projeto visa o desenvolvimento de um método de análise para determinação dos compostos em organismos de sapos da espécie Physalaemus cuvieri utilizando a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(HPLC).
MATERIAL E MÉTODOS: Todos os solventes utilizados nos experimentos foram grau cromatográfico da marca Lichrosolv Merck. Na etapa de extração e limpeza, foram utilizados: Celite 545 para retirada de interferentes como pigmentos e Lã de Vidro da marca Reagen. Para a evaporação dos extratos, utilizou-se um evaporador rotatório da marca Quimis modelo Q344B2. As análises dos compostos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência deu-se com um Cromatógrafo Líquido Shimatzu modelo LC20AT, acoplado a um Detector Fluorescência Shimatzu modelo RF-10AXL e coluna C18 octadecilsilano) com 250 x 4,6 mm e partículas de 5 μm (Phenomenex®) e pré-coluna C18 com 5 cm.
Foram pesados 5 gramas de amostra de sapos da espécie Physalaemus cuvieri, fortificadas com 0,5 mg L-1 de BPA e EE2, e submetidos à extração por Dispersão em Fase Sólida, onde utilizou-se a acetonitrila como solvente. Para realizar um clean-up no extrato obtido, foi necessária realização de uma extração líquido-líquido com N-Hexano. Ambos os extratos foram mantidos e evaporados, sendo retomados com 2 mL de acetonitrila cada. Depois de filtrados em Millex, os extratos foram injetados em sistema cromatográfico.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Após testes de parâmetros cromatográficos, as melhores condições para análise dos compostos foram: fase móvel ACN/H2O (50/50; v/v), em modo isocrático, fluxo 1mL min-1, λex=230 nm e λem=320 nm. Depois de feitas as injeções, observou-se que o método cromatográfico proposto pode ser o mesmo para os dois compostos, visto que o tempo de retenção de cada composto nas mesmas condições de análise são diferentes, o BPA 8,7 minutos e o EE2 com o tempo entre 11,5 minutos. Tendo esses parâmetros como base, construiu-se as curvas analíticas dos dois compostos (Figura 1) com as seguintes concentrações: 0,005; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 e 1 mg L-1. Os parâmetros já avaliados para desempenho do método foram: linearidade, sensibilidade, limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ) e seletividade. O método foi linear entre 2,5 a 100 μg L-1 para o BPA e 2,5 a 200 μg L-1 para o EE2. A sensibilidade do método para o BPA foi de 886,17 e para o EE2 1600,4. Os LDs e LQs estimados foram 0,46 e 1,53 μg L-1 para o BPA e 0,61 e 2,06 μg L-1 para o EE2 e a seletividade do método foi confirmada como mostra a figura 2, que comprova que mesmo na presença dos interferentes da matriz o método foi seletivo para identificação dos compostos. Segundo Ribani (2004) os intervalos de recuperação para análise de resíduos estão entre 70 e 120%, com precisão de até ± 20%. Porém, dependendo da complexidade analítica e da amostra, que é o caso deste trabalho, este valor pode ser de 50 a 120%, com precisão de até ± 15%. As recuperações encontradas nos testes para o BPA estão entre 65 e 73%. Os resultados do 17-etinilestradiol não encontram-se dentro do intervalo aceitável, necessitando de testes complementares.
CONCLUSÕES: A metodologia analítica proposta demonstra um método simples para análise de dois compostos juntos de efeito desregulador endócrino: Bisfenol-A e 17α-etinilestradiol, utilizando a Dispersão em Fase Sólida como método de extração e detecção por HPLC-FL. Dentre os ensaios realizados, a extração que utiliza a acetonitrila como solvente, seguido de clean-up com extração líquido-líquido realizada com N-hexano, foi a metodologia mais eficiente. Algumas modificações nos valores de fortificação do EE2 são necessárias para que a metodologia seja completa e realize-se a validação do método.
AGRADECIMENTOS: Universidade Federal do Maranhão (UFMA)
Programa de Pós-graduação de Biodiversidade e Conservação(UFMA)
Instituto Federal do Maranhão(IFMA)
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: MANN, R. M.; ROSS V. H., CHOUNG, C. B.; SCOTT. P. W.; Amphibians and agricultural chemicals: Review of the risks in a complex environment. Environmental Pollution 157, 2903–2927, 2009.
MEYER, A. et al. Estarão alguns grupos populacionais brasileiros sujeitos à ação de disruptores endócrinos?. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro: v.15, n.4, p. 845 850, out-dez, 1999.
NOGUEIRA, J. M. F. “Desreguladores Endócrinos: Efeitos Adversos e Estratégias para Monitoração dos Sistemas Aquáticos”, Química, v. 88, pp. 65-71, 2003.
RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C.l H. e JARDIM, I. C. S. F.; Validação Em Métodos Cromatográficos E Eletroforéticos. Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 771-780, 2004.
