ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: CONSTRUÇÃO DE BIOSSENSORES AMPEROMÉTRICOS À BASE DA ENZIMA ACETILCOLINESTERASE CONTENDO MACROALGA DE AMBIENTE ESTUARINO PARA DETECÇÃO DE AGENTES ANTICOLINESTERASE
AUTORES: MENDONÇA, C.D. (UFMA) ; SILVA, D.F. (UFMA) ; NUNES, G.S. (UFMA)
RESUMO: Neste trabalho, foi desenvolvido um estudo eletroanalítico parcial empregando biossensores amperométricos à base de AChE, para a sua posterior utilização na detecção de pesticidas organofosforados em águas naturais. Os biossensores foram construídos com a enzima AChE extraída de eritrócito bovino, tendo sido estes preparados a partir da adição da enzima à pasta de grafite modificada com o mediador tetracianoquinodimetano (TCNQ) em presença de uma macroalga obtida de regiões estuarinas e do álcool polivinílico contendo grupamentos estirilpiridínicos (PVA-SbQ). A partir de um potencial preestabelecido, foram realizadas as leituras cronoamperométricas de resposta da corrente elétrica até o ponto de saturação da enzima com o substrato cloreto de acetiltiocolina (ATChCl).
PALAVRAS CHAVES: biossensores. acetilcolinesterase. pesticidas organofosforados.
INTRODUÇÃO: Inseticidas organofosforados são compostos muito tóxicos, intensamente utilizados na agricultura. A sua presença no ambiente é muito prejudicial para saúde do homem, assim como eles inibem irreversivelmente a atividade catalítica dos sitios da acetilcolinesterase (AChE), que catalisa a hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ANDREESCU, BARTHELMEBS e MARTY, 2002). Técnicas amperométricas utilizando biossensores baseados na enzima acetilcolinesterase (AChE) têm emergido, nas últimas décadas, como uma técnica promissora para investigações de toxicidade, monitoramento ambiental, controle de qualidade de alimentos e investigações militares (SINHA et al, 2010). A principal aplicação de biossensores AChE é para a detecção de pesticidas organofosforados e carbamatos baseado na inibição enzimática. Estes dispositivos são projetados para complementar ou substituir os métodos analíticos de referência existentes (cromatográficos), simplificando ou eliminando a preparação da amostra, diminuindo assim o tempo de análise e os custos. Devido à natureza do processo de inibição e as dificuldade de regeneração da superfície do sensor, eletrodos descartáveis do tipo screen-printed (SPE) são muitas vezes preferido (SINHA et al, 2010). Este trabalho mostra resultados parciais de construção e caracterização de sensores do tipo screen-printed. O procedimento de imobilização enzimática foi otimizado de forma a resultar em menor perda de atividade da enzima (acetilcolinesterase) e os biossensores do tipo serigrafado foram preparados contendo as enzimas e o mediador, a partir do preparo de uma pasta sensível da enzima contendo uma macroalga.
MATERIAL E MÉTODOS: As medidas eletroquímicas foram feitas em um potenciostato/galvanostato e as medidas espectrofotométricas para determinação da atividade enzimática foram feitas em um espectrofotômetro UV/Vís antes da sua imobilização. A imobilização da enzima AChE foi realizada a partir da sua incorporação a uma pasta de PVA-SbQ, que favorecer a imobilização desta por meio de fotopolimerização; assim, o sensor foi preparado a partir da mistura desta pasta com uma pasta de grafite contendo o mediador TCNQ e uma macroalga da espécie Cladaphropsis membranacea hidrolisada e seca. A imobilização em presença de um mediador eletroquímico (no caso, TCNQ) tem como objetivos aperfeiçoar a habilidade e aumentar a transferência de elétrons através da modificação do eletrodo de trabalho, proporcionando um potencial baixo e reduzir a perda de atividade enzimática, obtendo sensores de elevada sensibilidade. Após preparo dos sensores, foi observada a interação enzima/substrato, a partir da medida da corrente final durante a reação enzimática e determinada a concentração do substrato que forneceu medidas de corrente em torno de 2000 nA.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Quando a enzima AChE é imobilizada na superfície do eletrodo, há interação com o substrato, produzindo uma espécie eletroativa. Nessa estratégia, acetiltiocolina pode substituir o substrato original da AChE, a acetilcolina. Assim, o novo substrato (acetiltiocolina) é hidrolisado da mesma forma como o substrato original, produzindo tiocolina e o ácido carboxílico correspondente (ácido acético, no caso). Os elétrons gerados durante a reação eletroquímica são coletados, e a corrente final é a medida quantitativa da atividade da enzima (NUNES, JEANTY e MARTY, 2004). No presente trabalho, o comportamento eletroquímico dos sensores foi inicialmente avaliado usando a técnica de voltametria de pulso diferencial em solução do substrato (ATChCl) em concentrações crescentes (1,0; 2,0; 5,0; 10; 15; 20 e 25mM), em presença de tampão fosfato pH 7,0. A combinação enzima-mediador-macroalga permitiu trabalhar em um potencial fixo de 250mV durante as medidas cronoamperométricas. Neste potencial, foi gerada uma corrente de 2500nA para 10mM do substrato, onde a partir de então ocorreu a saturação da enzima, ponto em que a reação enzima/substrato se completa. Na Figura 1, pode-se observar a estabilização da corrente, a partir de 10mM do substrato. Assim, o sensor apresentou elevada sensibilidade mesmo em concentrações do substrato relativamente baixas. Antes da incorporação da macroalga, foram registrados valores de correntes na ordem de 200-300nA, em concentração do substrato ATChCl próxima a 10mM (NUNES et al, 2008); na presença da macroalga, o valor da corrente obtida durante a reação enzimática cresceu cerca de 10 vezes, ou seja, para atingir valores de corrente na ordem de 200nA, basta realizar a reação enzimática em uma solução com [S] ~ 0,8 mM, o que torna o processo mais econômico.
CONCLUSÕES: A técnica de imobilização utilizada foi de fundamental importância, pois proporcionou uma boa estabilidade da enzima, reduziu custos e diminuiu o tempo para o procedimento de fixação da enzima no sensor. Devido à presença da macroalga, na camada sensível do biossensor, foi observada uma maior sensibilidade dos sensores frente ao substrato. Este processo pode se tornar mais viável e econômico, tanto que o sensor desenvolvido nesse trabalho será empregado para detecção futura de agentes inibidores de enzimas acetilcolinesterase, tais como os inseticidas organofosforados e carbamatos.
AGRADECIMENTOS:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: ANDREESCU, S.; BARTHELMEBS, L.; MARTY, J-L. Immobilization of acetylcholinesterase on screen-printed electrodes: comparative study between three immobilization methods and applications to the detection of organophosphorus insecticides. Analytica Chimica Acta, v. 464, p. 171–180, 2002.
NUNES, G. S. ; BADEA, M. ; MEDEL, M.L. ; NOGUER, T. ; MARTY, J. L. . Ultrasensitive biosensors for the detection of insecticide residues in fruit juices. Bulletin of Transilvania University of Brasov, v. 1, p. 29-36, 2008.
NUNES, G. S.; JEANTY, G.; MARTY, J. L. Enzyme immobilization procedures on screen-printed electrodes used for the detection of anticholinesterase pesticides comparative study. Analytica Chimica Acta, v.523, p. 107-115, 2004.
SINHA, R.; GANESAMA, M.; ANDREESCU, S.; STANCIU, L. AChE biosensor based on zinc oxide sol-gel for detection of pesticides. Analytica Chimica Acta, v. 661, p. 195-199, 2010.
