ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: Análise bioeletroquímica da interação entre o sistema híbrido de nanopartículas de ouro e lectina de Cratylia mollis com sorotipos de dengue.
AUTORES: AVELINO, K. Y. P. S. (CAV-UFPE) ; OLIVEIRA, M. D. L. (BIOQUÍMICA-U) ; CORREIA, M. T. S. (BIOQUÍMICA-U) ; DE MELO, C. P. (FÍSICA-UFPE) ; COELHO, L. C. B. B. (BIOQUÍMICA-U) ; OLIVEIRA, A. R. S. (CAV-UFPE) ; NOGUEIRA, M. L. (FAMERP) ; ANDRADE, C. A. S. (CAV-UFPE)
RESUMO: O presente trabalho tem como objetivo principal a avaliação físico-química da interação entre o sistema constituído por nanocompósitos de ouro, polianilina (NcAuPANI) e lectinas de Cratylia mollis (CramoLL ) com glicoproteínas anormais presentes nos sorotipos de dengue através das técnicas de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) e Voltametria Cíclica (VC). Baseado nos resultados obtidos observa-se que a lectina de Cratylia mollis se liga de forma específica à glicoproteínas anormais presentes no soro de pacientes infectados. O estudo demonstrou que as técnicas eletroquímicas podem ser utilizadas para monitorização interfacial de interações biomoleculares do tipo lectina-carboidrato para o desenvolvimento de um biossensor para dengue.
PALAVRAS CHAVES: dengue, lectina, impedância.
INTRODUÇÃO: A adsorção de moléculas de origem biológica em superfícies metálicas tem sido empregada para o desenvolvimento de sistemas biossensíveis. As lectinas são uma classe estruturalmente diversa de proteínas de origem não imunológica, capazes de se ligar de forma específica e reversível a carboidratos, podendo aglutinar células e precipitar glicoconjugados (SHARON, 1998; SHARON; LIS, 2004). A presença dessas proteínas na natureza é ampla e divergente, podendo ser encontradas em plantas, animais unicelulares, invertebrados e vertebrados superiores, além dos vírus (DÍAZ et al, 1999). Para imobilização de lectinas em eletrodos tem se empregado uma camada intermediária constituída por substâncias como os compostos híbridos de nanopartículas de ouro e polialinina, que apresentam características elétricas diferenciais ao facilitar a transferência de elétrons. Por estas propriedades, estes nanocompósitos estão sendo extensivamente utilizados para a construção de biossensores (HAN et al., 2011). No presente trabalho, as lectinas foram imobilizadas em eletrodo de ouro modificado por nanopartículas de ouro e polialinina. Após a obtenção da camada sensora, o eletrodo foi exposto aos sorotipos dengue I e II para detecção de glicoproteínas específicas. Esse estudo tem como objetivos analisar por meio de caracterização eletroquímica o processo de adsorção da lectina CramoLL em eletrodo modificado e a interação do sistema NcAuPANI-CramoLL com o soro de pacientes infectados com o dengue. Para caracterização destes experimentos utilizou-se como método de investigação da interface eletrodo-solução as técnicas de EIE e VC. Atualmente, por a dengue ser considerada um problema de saúde pública, o desenvolvimento de diagnósticos mais sensíveis e específicos para a dengue é de grande interesse.
MATERIAL E MÉTODOS: Os experimentos foram realizados em um Potenciostato/Galvanostato numa célula com três eletrodos contendo a solução de 10 mM de ferro-ferricianeto de potássio em uma proporção de 1:1 atuando como par redox. O eletrodo de trabalho utilizado foi o eletrodo de ouro, o eletrodo de contra-referência foi o eletrodo de platina e o de referência foi o eletrodo de Ag/AgCl saturado com KCl. Inicialmente, o eletrodo de trabalho foi polido em disco de feltro com alumina e submetido à sonicação em água deionizada por 3 minutos. Em seguida, neste eletrodo foi realizada uma análise eletroquímica com as técnicas de EIE e VC para verificação da limpeza da superfície de ouro. Posteriormente, o eletrodo foi lavado com água deionizada para remoção da solução ferro-ferricianeto de potássio, seco e imerso nos tempos de 1, 2, 3, 4 e 5 minutos no NcAuPANI diluído em etanol em uma proporção de 1:10, para determinação do tempo apropriado de imersão. Para modificação da superfície de ouro, o eletrodo foi polido e imerso por 2 minutos no sistema híbrido de NcAuPANI- CramoLL (2:1) e enxaguado suavemente com água deionizada para retirada do sistema não ligado. Após a avaliação eletroquímica e obtenção do eletrodo modificado com o sistema NcAuPANI-CramoLL, este foi exposto por 2 minutos aos sorotipos I e II de dengue que contém as glicoproteínas específicas para a determinação do diagnóstico da dengue e em seguida lavado com água ultra pura para separação das moléculas não reconhecidas. Estes sorotipos foram diluídos (1:10) em solução tampão com medidas equivalentes de fosfato de sódio monobásico e fosfato de sódio dibásico a 10mM em pH 7,4. As análises de EIE e VC foram realizadas a cada etapa de modificação do eletrodo para o monitoramento e caracterização da interface eletrodo-solução.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os estudos prévios da adsorção do NcAuPANI no eletrodo de ouro mostraram que a partir do tempo de 2 minutos houve uma intensificação desta imobilização, levando a um bloqueio da transferência de elétrons. De acordo com o gráfico de Nyquist pode-se observar um aumento da impedância (Figura 1). Os voltamogramas cíclicos demonstraram uma diminuição dos picos anódicos e catódicos. Logo, o tempo de imersão do eletrodo no NcAUPANI apropriado foi o de 2 minutos. Ao analisar os resultados da EIE observa-se que após a adição do sistema NcAuPANI/CramoLL à superfície de ouro houve uma diminuição da capacitância da dupla camada e aumento da resistividade da interface eletrodo-solução em comparação ao eletrodo limpo. Ao expor o eletrodo modificado à glicoproteínas dos sorotipos I e II da dengue estes resultados foram intensificados. Analisando o gráfico de Nyquist pode-se observar que o eletrodo biossensível reconheceu de forma mais acentuada o sorotipo dengue I (Figura 2). Nos voltamogramas cíclicos foi observado o mesmo comportamento das medidas de impedância na adsorção do sistema NcAuPANI/CramoLL e no reconhecimento das glicoproteínas de interesse. A cada etapa de modificação do eletrodo houve um aumento na dificuldade de passagem de elétrons da solução de ferro-ferricianeto de potássio à superfície do eletrodo, demonstrada pela diminuição da área dos voltamogramas cíclicos. De acordo com as informações obtidas pode-se observar uma melhor resposta do sistema biossensível para o sorotipo I da dengue uma vez que houve maior reconhecimento. Ao comparar os dados obtidos com os resultados de Oliveira (2009) pode-se afirmar a autenticidade do reconhecimento específico da lectina de Cratylia mollis por glicoproteínas presentes nos sorotipos I e II da dengue.
CONCLUSÕES: Através da EIE e VC foi possível caracterizar a interação do sistema de NcAuPANI e lectina CramoLL com glicoproteínas dos sorotipos I e II da dengue, demonstrando a especificidade da lectina de Cratylia mollis frente a carboidratos, em especial, a glicoproteínas do sorotipo dengue I. Portanto, as análises eletroquímicas podem ser utilizadas como ferramentas para a construção de biossensores para a dengue baseados no reconhecimento biológico de carboidratos de interesse pela lectina CramoLL, possibilitando o desenvolvimento de métodos diagnósticos mais sensíveis e específicos para a dengue.
AGRADECIMENTOS: CNPq, CAPES-Rede nanobio/ELINOR, FACEPE.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: DÍAZ, P. H.; GONZÁLES, O. M.; VÉLEZ, Y. R. P.; BAÉZ, F. A. G. 1999. Aplicaciones de lãs lectinas. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter, 15(2): 91-95.
HAN, J.; DAÍ, J.; LI, L.; FANG, P.; GUO, R. 2011. Highly uniform self-assembled conducting polymer/ gold fibrous nanocomposites: additive-free controllable synthesis and application as efficient recyclable catalysts. Langmuir, 27(6): 2181-2187.
OLIVEIRA, M. D. L.; CORREIA, M. T. S.; DINIZ, F. B. 2009. A novel approach to classify serum glycoproteins from patients infected by dengue using electrochemical impedance spectroscopy analysis. Synthetic Metals, 159: 2162 - 2164.
SHARON, N. 1998. Lectins: from obscurity into the limelight. Protein Science, 7: 2042-2048.
