ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: ESTUDO METALÔMICO DE COBALTO EM TECIDO MUSCULAR DE TILÁPIA DO NILO
AUTORES: CAVECCI, B. (IB - UNESP) ; MACHADO, A.U. (IB - UNESP) ; CAVALLINI, N.G. (IB - UNESP) ; LIMA, P.M. (IB - UNESP) ; SANTOS, F.A. (IB - UNESP) ; NEVES, R.C.F. (IB - UNESP) ; PADILHA, P.M. (IB - UNESP)
RESUMO: O presente trabalho teve como objetivo investigar a presença de cobalto em “spots” protéicos de amostras de tecido muscular de tilápia do Nilo obtidos após separação das proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida em segunda dimensão (2D-PAGE). Para avaliação qualitativa e quantitativa utilizou-se fluorescência de raios-X com radiação síncrotron (SR-XRF) e espectrometria de absorção atômica em forno de grafite (GFAAS). As análises dos espectros de fluorescência indicaram a presença de cobalto em três “spots” protéicos de tecido muscular. Observou-se que o cobalto está ligado em proteínas com massa molar de 11,2, 35,1 e 40,6 kDa e com pI de 9,6, 7,7 e 8,6, respectivamente. As concentrações de cobalto ligado a essas proteínas, determinada por GFAAS, foram de 5,20, 1,70 e 1,40 mg g-1.
PALAVRAS CHAVES: proteínas, nutrição de peixes, 2d-page.
INTRODUÇÃO: Estima-se que aproximadamente 40% de todas as proteínas dos organismos vivos necessitam de um metal/metalóide para apresentar atividade biológica (Garcia et. al, 2006). O cobalto é componente da cianocobalamina (vitamina B12), constituindo cerca de 4,5 % da sua massa molar. A vitamina B12 é essencial em diversas reações bioquímicas na natureza, a maioria das quais implica redistribuição de hidrogênios e de carbono, atuando como um co-fator essencial para duas enzimas: metionina sintase e L-metilmalonil-coA mutase, ambas direta ou indiretamente envolvidas no metabolismo da homocisteína (Barrios et. al, 1999).
Nesse contexto, o desenvolvimento de metodologias analíticas que permitam uma avaliação segura das metaloproteínas e/ou proteínas ligadas a metais presentes no sangue e em tecidos de animais é de fundamental importância (Santos et. al, 2011). Com base no exposto, o presente trabalho teve como objetivo mapear e quantificar cobalto em spots protéicos de amostras de tecido muscular de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), separadas por 2D-PAGE, utilizando fluorescência de raios-X (SR-XRF) e espectrometria de absorção atômica (GFAAS).
MATERIAL E MÉTODOS: Um pool de amostras de músculo de tilápia do Nilo foi macerado em água deionizada, com auxílio de almofariz e pistilo. Os extratos obtidos foram separados da fase sólida por centrifugação e transferidos para tubos do tipo Eppendorf. Posteriormente, as proteínas presentes no extrato foram precipitadas com acetona na proporção 1:4. Os precipitados foram solubilizados em tampão específico e aplicados em fitas de IOF com gel pré-fabricado com anfólitos imobilizados (pH 3 a10). Depois de hidratadas por 12 h as fitas foram levadas ao sistema de IOF para corrida em primeira dimensão. Após essa etapa, as fitas foram equilibradas em tampão específico por 15 minutos e aplicadas em géis de poliacrilamida a 10% m/v juntamente com padrões de massa molar, para corrida em segunda dimensão. Ao término das etapas de separação (feitas em triplicata), os spots protéicos foram fixados no gel e corados com Coomassie Blue. Em seguida, os spots foram recortados do gel e secos com lâmpada infravermelha para análise por SR-XRF com feixe de 500 µm, com leitura em dois pontos do spot e tempo de 200 segundos. Finalmente, os spots que apresentaram cobalto foram submetidos à mineralização ácida para posterior quantificação por GFAAS.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A Figura 1 apresenta o gel com a identificação dos spots protéicos analisados por SR-XRF que apresentaram cobalto e a Figura 2 apresenta como exemplo, um dos espectros de fluorescência obtidos nas análises por SR-XRF dos “spots” protéicos das amostras de tecido muscular. A análise dos espectros de fluorescência obtidos por SR-XRF indicaram cobalto (K1 = 6,93 keV e K1 = 7,65 keV) em três spots protéicos com massas molares de 11,2 (spot M18), 35,1 (spot M4) e 40,6 kDa (spot M7) e com pI de 9,6, 7,7 e 8,6, respectivamente. Nesses spots também foram detectados a presença de cálcio, ferro e cobre (spot M4); cálcio (M7); cálcio e selênio (M18). A presença de mais de um íon metálico ligado a uma metaloproteína é aceitável, considerando que devido a presença de vários sítios ativos, uma única proteína pode se ligar com um ou vários elementos, de acordo com suas propriedades (Lima et. al, 2010). Os valores das concentrações de cobalto nos spots protéicos foram de 1,70 (spot M4), 1,40 (spot M7) e 5,20 mg.g-1 (spot M18). Com base nas concentrações de cobalto nos spots protéico foi possível estimar a proporção de cobalto por molécula de proteína. No caso, pode-se inferir que os spots protéicos (M4, M7 e M18) apresentam um átomo de cobalto por molécula de proteína (Lima et. al, 2010).
CONCLUSÕES: A utilização da eletroforese 2D-PAGE foi eficiente no fracionamento das proteínas presentes em amostras de músculo de tilápia do Nilo, obtendo boa correlação nas repetições dos géis, uma vez que os procedimentos de extração de proteínas totais preservaram a estrutura metal-proteína, possibilitando o mapeamento de cobalto nos “spots” protéicos por SR-XRF e posterior quantificação do mesmo por GFAAS. Estimando assim que as proteínas analisadas apresentam proporções de um átomo de cobalto por molécula de proteína, indicando, que podem ser metaloproteínas.
AGRADECIMENTOS:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: GARCIA, J.S., MAGALHÃES, C.S., ARRUDA, M.A.Z. Trends in metal-binding and metalloprotein analysis. Talanta v.69, p.1-15, 2006.
BARRIOS, M. F. et al. Vitamina B12: metabolismo y aspectos clínicos de su deficiencia. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter, v. 15, n. 3, p. 159-74, 1999.
LIMA P. M., NEVES R. C. F., SANTOS F. A., PÉREZ C. A., SILVA M. A. O., ARRUDA M. A. Z., CASTRO G. R., PADILHA P. M. Analytical approach to the metallomic of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) liver tissue by SR-XRF and FAAS after 2D-PAGE separation: Preliminary results. Talanta v. 82, p. 1052-1056, 2010.
SANTOS F. A., LIMA P. M., NEVES R. C. F., MORAES P. M., PÉREZ C. A., SILVA M. A. O., ARRUDA M. A. Z., CASTRO G. R., PADILHA P. M. Metallomic study of plasma samples from Nile tilapia using SR-XRF and GFAAS after separation by 2D PAGE: Initial results. Microchimica Acta v. 173, p. 43-49, 2011.
