ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: UTILIZAÇÃO DA METALÔMICA NO MAPEAMENTO DE MERCÚRIO EM PEIXES DA BACIA DO RIO MADEIRA - RO
AUTORES: CAVALLINI, N.G. (IB - UNESP) ; MACHADO, A.U. (IB - UNESP) ; SANTOS, F.A. (IB - UNESP) ; CAVECCI, B. (IB - UNESP) ; MORAES, P.M. (IB - UNESP) ; CASTRO, G.R. (IB - UNESP) ; PADILHA, P.M. (IB - UNESP)
RESUMO: O presente trabalho teve como objetivo investigar a presença de mercúrio em “spots” protéicos de amostras de tecido muscular de dourada e pacú coletados na Bacia do Rio Madeira – RO. Os spots protéicos foram obtidos após separação das proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida em segunda dimensão (2D PAGE). O mapeamento de mercúrio nos spots protéicos foi feito por Fluorescência de Raios-X com Radiação Síncrotron (SR-XRF). As análises dos espectros de fluorescência indicaram a presença de mercúrio (L1 = 9,4) em dois spots protéicos, sendo um spot das amostras de tecido muscular da dourada e outro do pacú. Os spots protéicos apresentaram massa molar de 23,0 e 25,1 e ponto isoelétrico (pI) de 5,8 e 7,7, respectivamente.
PALAVRAS CHAVES: metaloproteínas, 2d page, sr-xrf
INTRODUÇÃO: A construção de complexos hidrelétrica no rio Madeira pode provocar processos de remobilização das espécies mercuriais, o que poderá contribuir para a bioacumulação e biomagnificação dessas espécies ao longo da cadeia trófica (BASTOS & LACERDA, 2004). Estima-se que cerca de 50 toneladas de mercúrio liberadas para o ambiente das atividades de ouro de garimpo, teriam se depositado nos corpos d’água e em solos próximos as margens do rio Madeira. Além disso, existe o mercúrio de origem natural, originário da Cordilheira dos Andes em função da erosão natural vulcânica (LACERDA et. al., 2004). A elucidação dos mecanismos de toxicidade do mercúrio é fundamental para o desenvolvimento sócio-ambiental dessa região. A metalômica, área científica proposta recentemente, permitiu a integração de estudos analíticos e bioquímicos, contemplando seqüenciamento e caracterização de proteínas associadas a metais. Esta nova área de conhecimento científico poderá contribuir na elucidação dos aspectos fisiológicos e funcionais das metaloproteínas responsáveis pelo transporte de mercúrio nos organismos vivos (GARCIA et. al., 2006). Considerando o exposto, o presente trabalho apresenta resultados preliminares do estudo metaloproteômico de mercúrio em peixes do AHE JIRAU – Bacia do rio Madeira utilizando-se 2D PAGE e SR-XRF, tendo como principal objetivo, a possível identificação de proteínas biomarcadoras de mercúrio.
MATERIAL E MÉTODOS: Um pool de amostras de músculo de dourada (Brachyplatystoma rousseauxii) e pacú (Mylossoma sp., Myleus sp.) foi macerado em água deionizada, com auxílio de almofariz e pistilo. Os extratos obtidos foram separados da fase sólida por centrifugação e transferidos para tubos do tipo Eppendorf. As proteínas presentes nos extratos foram precipitadas com acetona a 80% v/v. Os precipitados obtidos foram solubilizados em tampão específico e aplicados em fitas de IOF com gel pré-fabricado com anfólitos imobilizados. Após hidratação por 12 h as fitas foram levadas ao sistema de IOF para corrida em primeira dimensão. Após essa etapa, as fitas foram equilibradas em tampão específico por 15 minutos e aplicadas em géis de poliacrilamida a 12 % m/v juntamente com padrões de massa molar, para corrida em segunda dimensão. Ao término das etapas de separações, os spots protéicos foram fixados no gel e corados com Coomassie Blue. Os géis obtidos foram, por fim, digitalizados em Scanner GE Healthcare e a análise das imagens foi feita utilizando-se o programa ImageMaster 2D Platinum da GE Healthcare. Após o tratamento das imagens dos géis, os spots protéicos foram recortados do gel, liofilizados e analisados por SR-XRF para determinação qualitativa de mercúrio (Lima et. al, 2010).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os géis obtidos para as amostras de tecido muscular de dourada (1a) e pacú (1b) são apresentados na Figura 1. Analisando-se a Figuras 1a e 1b, observa-se que os géis apresentam grande diversidade de spots protéicos, alguns com maior intensidade, e mais concentrados na região com pI entre 6 e 9 e massa molar em torno de 30-45 kDa. A análise de correlação entre os géis obtidos demonstrou que 65% e 73% dos spots protéicos estavam presentes nos quatro géis das amostras de tecido muscular de dourada e pacu, respectivamente. As Figuras 2 e 3 apresentam os espectros de fluorescência dos spots 68 e 72 (destacados em vermelho nas Figuras 1a e 1b), nos quais foi identificado mercúrio nas amostras de tecido muscular de dourada e pacu, respectivamente. Observa-se que os espectros de SR-XRF apresentam fundo contínuo de bastante intensidade. Tais fundos devem-se, principalmente, ao espalhamento Compton dos raios-X incidentes sobre a matriz do gel, o qual pode mascarar os sinais do elemento de interesse (Lima et. al., 2010). Dessa forma, utilizando os valores das áreas dos picos normalizados (após desconto do branco analítico) dos espectros de SR-XRF, foi possível identificar mercúrio (L1 = 5,898 keV) ligado às proteínas dos spots 68 (Massa Molar de 25,1 kDa e pI de 5,8) e 72 (Massa Molar de 23,0 kDa e pI de 7,7) das amostras de músculo de dourada e pacu – spots estes destacados com um círculo nos géis apresentados na Figura 1. Nesse spot também foi detectado a presença de enxofre (K1 = 2,308 keV), o que sugere que essas proteínas apresentam cadeias laterais com grupos tióis (base mole), que apresentam grande afinidade por ácidos moles, como no caso, o mercúrio.
CONCLUSÕES: A utilização da 2D PAGE como etapa inicial no estudo metalômico do mercúrio em amostras de músculo de pacu e dourada do rio Madeira foi eficiente na extração das proteínas, preservando a estrutura metal-proteína, o que possibilitou a identificação desse elemento em dois spots protéicos por SRXRF.
AGRADECIMENTOS: Os autores agradecem à FAPESP, CNPq, FUNDIBIO e LNLS.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA:
BASTOS W. R., LACERDA, L. D. A contaminação por mercúrio na bacia do rio madeira: uma breve revisão. Geochim. Brasil. V. 18(2), p. 99-114, 2004.
BASTOS W. R., ALMEIDA R., ZARZ L. F., ROCHA J. C., SANTOS A. Programa de Monitoramento Hidrobiogeoquímico do AHE JIRAU – Bacia do Rio Madeira. Tectebel Energia, 2009.
GARCIA, J.S., MAGALHÃES, C.S., ARRUDA, M.A.Z. Trends in metal-binding and metalloprotein analysis. Talanta, v.69, p.1-15, 2006.
LIMA P. M., NEVES R. C. F., SANTOS F. A., PÉREZ C. A., SILVA M. A. O., ARRUDA M. A. Z., CASTRO G. R., PADILHA P. M. Analytical approach to the metallomic of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) liver tissue by SR-XRF and FAAS after 2D-PAGE separation: Preliminary results. Talanta v. 82, p.1052-1056, 2010.
