ÁREA: Materiais
TÍTULO: Construção de um bioeletrodo para o diagnóstico de hepatite B usando poli (4-aminofenol) como matriz
AUTORES: A.C.H.CASTRO (UFU) ; E.G.FRANCA (UFU) ; J.M.MADURRO (UFU) ; A.G.BRITO-MADURRO (UFU)
RESUMO: Eletrodos modificados com filmes poliméricos têm se mostrado promissores para o desenvolvimento de bioeletrodos visando o diagnóstico de doenças. Neste trabalho foram utilizados eletrodos de grafite modificados com poli(4-aminofenol) para detecção indireta da hibridização de fragmentos de DNA específicos para o vírus da hepatite B. O bioeletrodo produzido é capaz de discriminar mismatch de três bases
PALAVRAS CHAVES: poli (4-aminofenol), bioeletrodo, diagnóstico, hepatite b
INTRODUÇÃO: Hepatite B é considerada um problema de saúde pública, visto que acomete aproximadamente 2 bilhões de pessoas em todo o mundo. O espectro da doença é muito variável, abrangendo desde um estado de baixo viremia á uma hepatite crônica progressiva, podendo evoluir para cirrose e carcinoma hepatocelular (CASTELO et al., 2007).
O diagnóstico da hepatite B é feita por vários testes serológicos, tais como a quantificação das marcadores hepáticos (enzimas específicas) e a determinação da quantidade de vírus no sangue por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (JAFRI & LOK, 2010).
O desenvolvimento de biossensores para diagnóstico de doenças tem sido alvo de estudo por vários grupos de pesquisa, buscando dispositivos sensíveis, específicos, de baixo custo e de fácil manuseio. As técnicas eletroquímicas são as que concentram o maior número de trabalhos realizados devido à facilidade no processo e na instrumentação, resultados rápidos e confiáveis. (SHANKARAN et al., 2007).
Este trabalho visou a utilização de eletrodos modificados com poli (4-aminofenol) para a imobilização e detecção de oligonucleotideo específico para o vírus da hepatite B, bem como o mismatch de 3 bases. Oligonucleotídeos sintéticos foram imobilizados e detectados com sucesso, por meio de detecção indireta, usando brometo de etídio como indicador da hibridação da dupla fita do DNA.
MATERIAL E MÉTODOS: A polimerização eletroquímica e as medidas voltamétricas foram realizadas em células de três compartimentos, acoplados a um Potenciostato CH Instruments 420A. Um disco de grafite com 6 mm de diâmetro foi obtido a partir de um bastão de grafite com 99.9995 % de pureza e utilizado como eletrodo de trabalho. Platina foi utilizada como contra eletrodo e prata-cloreto de prata (Ag/AgCl (KCl 3M) como eletrodo de referência. Todos os experimentos foram realizados à temperatura ambiente.
A solução de 4-aminofenol foi deaerada com nitrogênio ultra puro por 45 minutos antes da eletropolimerização, que foi realizada sobre um eletrodo de grafite com ciclos contínuos do potencial de acordo com Vieira et al (Vieira et al; 2006). Posteriormente o eletrodo modificado foi lavado em água deionizada.
Os fragmentos de DNA da hepatite B foram sintetizados pela Alpha DNA (Canada) com a seguinte sequências:
Sonda (HepB1):5'-GAGGAGTTGGGGGAGCACATT-3 ',
Alvo (HepB2): 5'-AATGTGCTCCCCCAACTCCTC-3',
Mismatch (Mis3HepB): 5'-AATGTGCTCTTTCAACTCCTC-3`.
A imobilização foi feita por gotejamento de 0.063x10-6 micromol.L-1 HepB1 sobre o eletrodo modificado com poli(4-aminofenol). O eletrodo foi imerso em solução de alnumina bovina 0,5% por 2 horas. A seguir foi adicionado 1,8 x10-6 micromol.L-1 de HepB2. A hibridização foi realizada a 55 oC por 15 minutos. A eletrodetecção foi realizada monitorando adicionado-se 20x10-3 mol. L-1 de brometo de etideo. Para verificar a resposta do mismatch, o processo descrito anteriormente foi realizado.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Experimentos visando a detecção indireta de fragmento de DNA específico para a hepatite B (HepB2) usando brometo de etídio como indicador de hibridização são mostradas na figura 1.
A Figura 1 mostra que o potencial de oxidação de brometo de etídio é cerca de +0.65V. Quando ocorre a interação HepB1:HepB2, o brometo de etídio intercala na dupla fita do DNA aumentando a concentração de indicador da hibridação sobre a superfície do eletrodo modificado, indicando a ocorrência do evento de hibridação.
Experimentos foram conduzidos usando mismatch de três bases (Figura 2).
Como mostrado na figura 2, o sinal de oxidação do brometo de etídio apresenta diferenças na amplitude de sinal de corrente após hibridização com mismatch de três bases (Mis3HepB, fig2b) e com o alvo complementar (HepB2, fig2c), sugerindo que o bioeletrodo é promissor para avaliar sequências de DNA com mutações e de doenças que sofrem constantes alterações em seu material genético. Em adição, este resultado também indica que o bioeletrodo é seletivo.
CONCLUSÕES: Foi possível detectar a hibridização do alvo complementar por oxidação indireta usando brometo de etídio como indicador de hibridação. O bioletrodo também é capaz de discriminar mismatch de 3 bases.
O eletrodo modificado com poli (4-aminofenol) utilizado na imobilização de sondas de DNA mostrou-se promissor para a detecção do vírus da hepatite B em amostras reais.
AGRADECIMENTOS: Os autores agradecem a CAPES, CNPq, FAPEMIG e PROPP-UFU pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: CASTELO, A.; PESSÔA, M. G.; BARRETO, T. C. B. B.; ALVES, M. R. D.; ARAÚJO, D. V. Estimativas de custo da hepatite crônica b no sistema único de saúde brasileiro em 2005. Revista da Associação Médica Brasileira, v.53, p. 486-491, 2007.
JAFRI, S-M. R.; LOK, A. S-F. Antiviral Therapy for Chronic Hepatitis B. Clinics in Liver Disease, v.14, p. 425-438, 2010.
SHANKARAN, D. R.; GOBI, K. V.; MIURA, N. Recent advancements in surface plasmon resonance immunosensors for detection of small molecules of biomedical, food and environmental interest. Sensors and Actuators B, v.121, p. 158-177, 2007.
VIEIRA, S. N.; FERREIRA L. F.; Franco D. L.; AFONSO A. S.; GONÇALVES, R. A.; BRITO-MADURRO, A. G.; MADURRO, J. M.. Electrochemical modification of graphite electrodes with poly(4-aminophenol), Macromol. Symp.,v.245-246, p. 236-242, 2006.
