51º CBQ - TORTAS DE SOJA E MAMONA COMO SUBSTRATOS PARA PRODUZIR LIPASE PELO Botryosphaeria ribis EC-01 POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO PLANEJAMENTO FATORIAL

ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia

TÍTULO: TORTAS DE SOJA E MAMONA COMO SUBSTRATOS PARA PRODUZIR LIPASE PELO Botryosphaeria ribis EC-01 POR FERMENTAÇÃO SUBMERSA UTILIZANDO PLANEJAMENTO FATORIAL

AUTORES: ANDRADE, M.M (UEL) ; ZAMINELLI, T. (UEL) ; BARBOSA, A.M (BRI) ; OLIVEIRA, B.H. (UNESP) ; LIMA, V.M.G (UNESP) ; DEKKER, R.F.H (BRI) ; SCARMINIO, I.S. (UEL) ; DALL'ANTONIA, L.H. (UEL)

RESUMO: Sub-produtos de industrias de óleos constituem substratos para fungos produtores de lipases, as quais catalisam a síntese de biodiesel. Um planejamento fatorial 24 foi utilizado para avaliar a produção de lipases pelo fungo Botryosphaeria ribis avaliando-se as variáveis concentrações de tortas de soja e mamona, glicerol e KH2PO4 em água destilada. A torta de soja foi a variável que mais influenciou positivamente (210,5 %) a produção de lipase em atividade especifica e 405,4 % em volumétrica, seguida pelo glicerol em g/ss. Portanto, estas serão as variáveis a serem utilizadas nos futuros experimentos de otimização desta enzima. A torta de mamona não afetou a produção da lipase, enquanto que o KH2PO4 proporcionou um efeito antagônico na sua produção na presença de torta de soja e glicerol.

PALAVRAS CHAVES: lipase, torta de soja, glicerol.

INTRODUÇÃO: As lipases (EC 3.1.1.3; triacilglicerol acilhidrolases) são enzimas que catalisam a hidrólise de triacilgliceróis em diacilgliceróis, monoacilgliceróis, ácidos graxos e glicerol na interface entre as fases aquosa e lipídica. Estas enzimas são amplamente distribuídas em plantas, animais e micro-organismos (JAEGER; EGGERT, 2002), entretanto uma das limitações de seu uso em processos industriais é o alto custo. Resíduos agroindustriais podem ser substratos para o desenvolvimento de microrganismos e concomitante produção de enzimas diminuindo o custo de produção. O planejamento fatorial também constitui uma ferramenta estatística muito útil para aumentar a produção de enzimas, através da avaliação de variáveis que influenciam na síntese destes catalisadores, contribuindo para a diminuição do custo de produção. O óleo de soja e tortas (subprodutos resultantes após a extração de óleo de soja, girassol, oliva, mamona, canola e coco) tem sido relatados como substratos importantes para a produção de lipases pelo Botryosphaeria ribis (BARBOSA et al., 2011), previamente selecionado como produtor de lipase em óleos vegetais (MESSIAS et al., 2009). Este trabalho objetivou avaliar a influencia da adição das tortas de soja e mamona, glicerol e KH2PO4 em água destilada para cultivar o Botryosphaeria ribis e produzir lipase sob fermentação submersa, utilizando um planejamento fatorial 24 e analise por metodologia de superfície de resposta (MSR).

MATERIAL E MÉTODOS: O B. ribis foi mantido em BDA (batata-dextrose agar) a 4 ºC e transferido para placas contendo meio mínimo de Vogel, glucose (1%, m/v) e agar (2%, m/v) durante 5 dias a 28 ºC. Quatro esferas de ~0,7 cm de diâmetro foram inoculadas em frascos de Enlenmeyer de 125 mL contendo 25 mL de água destilada, torta de soja, mamona, glicerol e KH2PO4, de acordo com o delineamento composto 24 descrito na Tabela 1. Os cultivos foram mantidos a 28ºC e 180 rpm por 5 dias. A análise dos resultados foi realizada utilizando o software computacional STATISTICA v. 8.0 (Statsoft Inc.). Os sobrenadantes obtidos após centrifugação foram utilizados como extratos enzimáticos. A atividade de lipase foi determinada por espectrofotometria, utilizando-se o palmitato de p-nitrofenila (pNPP) como substrato a pH 8,0 e 55 ºC, por 2 min., a 410 nm (MESSIAS et al., 2009). A unidade de lipase foi definida como a liberação de 1 µmol de p-NPP por minuto por mL da solução de enzima. As proteínas foram determinadas pelo método de Bradford (1976).

RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os resultados do delineamento para a produção de lipase em atividade específica (U/mg) indicaram que o aumento da concentração da torta de soja (X1) proporcionou um aumento médio de 210,56%, enquanto que as demais variáveis e interação entre as mesmas não foram estatisticamente significativas (p<0,10). O modelo obtido a partir do planejamento experimental foi estatisticamente significativo e preditivo (Eq. 1). A partir do modelo foi possível construir as superfícies de resposta apresentadas na Figura 1, onde foi observado o direcionamento das condições para atingir o ótimo de atividade lipolítica específica.
Eq. 1: U/mg = 138,49 + 49,56.X1 + 24,86.X3 + 11,89.(X2.X1) + 29,65.(X1.X3) + 7,56.(X4.X1) - 10,39.(X2.X3) - 35,33.(X4.X3) + 32,52.
Quanto à atividade volumétrica (U/mL) o aumento foi de 405,4% na produção de lipase, enquanto que o aumento de X4 demonstrou efeito antagônico. As demais variáveis não foram estatisticamente significativas (p<0,10). Com relação à atividade por grama de substrato seco (U/gss), o aumento de glicerol (X3) promoveu 151,83% de aumento na produção de lipase. Torta de soja foi também avaliada por Tan et al. (2004) e He e Tan (2006) na produção de lipase tendo apresentado efeito significativo aumentando a atividade volumétrica da lipase de Penicillium camembertii e Candida sp., respectivamente.

CONCLUSÕES: As concentrações de torta de soja e glicerol foram as variáveis que exerceram maior efeito na síntese de lipase pelo Botryosphaeria ribis, indicando que estas variáveis devem ser utilizadas em um próximo planejamento para otimizar a produção desta enzima por fermentação submersa. A adição de KH2PO4 exerceu efeito negativo na síntese desta enzima, enquanto que a torta de mamona não apresentou nenhum efeito na produção da enzima, sendo, portanto desnecessária sua adição na presença de torta de soja.

AGRADECIMENTOS: CAPES, CNPq, Fund. Araucária –PR (Proj. 15285 Cham. 14/2008), FAPESP (Proc. 2010/07998-9) e PROPPG-UEL (Proj: 062446).

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BARBOSA, A.M.; MESSIAS, J.M.; ANDRADE, M. M.; DEKKER, R.F.H.; VENKATESAGOWDA, B. Soybean oil and meal as substrates for lipase production by Botryosphaeria ribis, and soybean oil to enhance the production of Botryosphaeran by Botryosphaeria rhodina. In: Soybean, Biochemistry, Chemistry and Physiology. p. 101-118, Tzi Bun Ng, Intech, Rijeka, Croatia, 2011.

BRADFORD M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. 1976. Analytical Biochemistry, 72: 248-254.

HE, Y.Q.; TAN, T.W. Use of response surface methodology to optimize culture medium for lipase for production of lipase with Candida sp. 99-125. 2006. Journal of Molecular Catalysis. B, 43: 9-14.

JAEGER, K.E.; EGGERT, T. Lipases for biotechnology. 2002. Current Opinion in Biotechnology, 13: 390-397.

MESSIAS, J.M.; COSTA, B.Z.; LIMA, V.M.G; DEKKER, R.F.H.; REZENDE, M.I.; KRIEGER, N.; BARBOSA, A.M. 2009. Screening Botryosphaeria species for lipases: Production of lipase by Botryosphaeria ribis EC-01 grown on soybean oil and other carbon sources. Enzyme and. Microbial Technology, 45: 426-431.

TAN, T.; ZHANG, M.; XU, J.; ZHANG, J. Optimization of culture conditions and properties of lipase from Penicillium camembertii Thom PG-3. 2004. Process Biochemistry, 39: 1495-1502.