ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: COMPARAÇÃO DE METODOLOGIA PARA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE LIPOLÍTICA DE Aspergillus sp.
AUTORES: SANTOS, N.P (UFSJ) ; ALMEIDA, F.G.O. (UFSJ) ; RESENDE, R.R. (UFSJ) ; FERNANDES,O.C.C. (FIOCRUZ MANA) ; FERREIRA, J.S. (UFSJ) ; CARNEIRO, A.L.B (UFAM) ; SILVA, J.C. (FIOCRUZ MANA) ; SILVA, S.L. (UFSJ) ; LONGATTI, T.R. (UFSJ) ; ALEIXO,A.A. (UFSJ) ; CARNEIRO,P.G. (UFSJ)
RESUMO: Fungos do gênero Aspergillus sp. são bons produtores de lipases, enzimas com vastas aplicações biotecnológicas. Os produtos da degradação de óleos vegetais pela lipase incluem ácidos graxos. São necessários métodos seguros de quantificá-los, a fim de determinar indiretamente o teor de lipase produzido. Duas técnicas de titulação potenciométrica são propostas: extração pré-titulação e titulação direta. O objetivo deste trabalho é determinar qual das duas técnicas é mais indicada para esta quantificação. Inóculos da mesma cepa foram crescidos sob as mesmas condições (140rpm, 28ºC) e titulados em triplicata num intervalo de 24h durante seis dias. A titulação direta mostrou-se mais adequada que a indireta, pois apresentou maior reprodutibilidade, apesar de possuir menor sensibilidade.
PALAVRAS CHAVES: lipase, titulação, método
INTRODUÇÃO: Lipases são enzimas capazes de hidrolisar e sintetizar ésteres a partir de gliceróis e ácidos graxos (SALEH et al., 2010), possuindo inúmeras aplicações biotecnológicas como na produção de biodiesel, síntese de fármacos e indústria de cosméticos. Entre os microrganismos conhecidamente capazes de sintetizá-las estão os fungos filamentosos do gênero Aspergillus sp.. Entre os métodos capazes de detectá-las pode-se citar o método pH-stat de titulação potenciométrica. Ele é usado como referência para a análise de lipases por ser uma técnica barata e conveniente; é um método sensitivo quantitativo no qual os limites de detecção são de no mínimo 0.1µmol e no máximo 1µmol de ácido graxo liberados por minuto. (HASAN et al., 2009) . Quando trata-se das titulações potenciométricas é necessário ainda estabelecer qual a melhor técnica a ser usada. Como exemplo de técnica aplicável está a de extração pré-titulação, onde o ácido graxo a ser titulado é previamente extraído do meio de cultura por meio de um solvente de alta afinidade. A mistura contendo-o é separada e só então titulada. Outra técnica disponível é a da titulação direta, ou seja, o ácido graxo não é extraído e sim imediatamente titulado após a retirada do micélio. Um parâmetro influente na atividade lipolítica do fungo é o substrato que, quando variado em culturas de uma mesma cepa, apresenta valores diferentes de enzima produzida. Para testar-se a produção de lipase, uma técnica recorrente é a substituição de açúcares de meios de cultura convencionais, como o czapek, por óleos vegetais - geralmente o de oliva (HASAN et al., 2009). Essa prática garante que o metabólito de interesse produzido partiu única e exclusivamente da fonte carbônica desejada (o óleo).
MATERIAL E MÉTODOS: Foram preparados, para cada técnica testada de titulação potenciométrica, cerca de 20 erlenmeyers com 70mL de meio czapek sem dextrose. A cada erlenmeyer foi adicionado 2,5mL de óleo comercial de oliva e inóculo de 106 esporos de Aspergillus flavus. As condições de crescimento foram de 140rpm a 28ºC. As titulações dos triacilgliceróis produzidos foram efetuadas em intervalos de 24h durante seis dias para as duas técnicas testadas. A titulação potenciométrica com pré-extração procedeu da seguinte maneira: ao erlenmeyer contendo o micélio e o ácido graxo foram adicionados 60mL de mistura tolueno/ etanol (7:3). Após vigorosa agitação, a fase orgânica foi separada do restante do meio com auxílio de uma pipeta de Pasteur. A mistura contendo o tolueno, o etanol e o ácido graxo extraído foi titulada por um titulador potenciométrico. A segunda técnica avaliada de titulação potenciométrica, a titulação direta, seguiu-se com a filtração a vácuo do conteúdo do erlenmeyer para eliminação do micélio, sem extração prévia do analito. Para minimizar as perdas de ácido graxo que supostamente permaneceu aderido ao erlenmeyer e funil de Buchner, empregou-se a lavagem com isopropanol. A cada 24h três erlenmeyers foram titulados para cada técnica, contabilizando cerca de 36 erlenmeyers no experimento. Após a coleta dos dados no final do sexto dia foram calculadas as médias de mols de titulante gastos a cada intervalo de tempo (24h, 48h, 72h...), assim como o desvio padrão para cada medida.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A titulação indireta, onde foi aplicada a extração com solução tolueno/ etanol (7:3), apresentou os maiores valores de ácido graxo titulado, atingindo a marca máxima de 1,8788 mols (4º dia de crescimento, 96h a partir da inoculação) com um desvio padrão de 87,92. Por outro lado, a titulação direta, na qual o micélio foi previamente eliminado, revelou um valor máximo medido de 0,7001 mols (4º dia de crescimento, 96h após inoculação) com um desvio padrão de 16,05. A maior variação nos resultados da titulação com pré-extração aconteceu porque ela depende muito do operador: procedimentos simples, porém essenciais, como uma agitação padronizada no momento da extração, o recolhimento do máximo possível de fase orgânica com a pipeta de Pasteur e o respeito ao tempo de espera para que as duas fases, o meio de cultura e a mistura de solventes orgânicos , se separem, devem ser seguidos com rigor para que as amostras sejam avaliadas sob condições semelhantes. Entretanto, o número de mols do titulante foi o maior provavelmente porque com a extração minimiza-se os interferentes do eletrodo da titulação, dando a ele maior sensibilidade. Na titulação direta (sem pré-extração) as perdas poderiam ocorrer no momento da extração do micélio, mas isto foi minimizado com a lavagem com isopropanol, o que nos leva a crer que o desvio padrão encontrado é devido, majoritariamente, ao próprio crescimento desigual dos fungos, mesmo sob condições semelhantes de incubação. Admitimos, para esta técnica, um maior número de interferentes no eletrodo no momento da titulação, exibindo assim um menor número de mols de titulante gasto graças a sua sensibilidade reduzida.
CONCLUSÕES: A partir dos experimentos efetuados, pode-se afirmar que a titulação potenciométrica direta mostrou-se mais aplicável à finalidade proposta e, portanto, mais eficiente na quantificação indireta de lipase em cultivo de fungos filamentosos do gênero Aspergillus sp. Seu menor desvio padrão sugere que, apesar de sua menor sensibilidade, o método apresenta uma maior reprodutibilidade que o de titulação com pré-extração.
AGRADECIMENTOS: CNPQ, UFSJ
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: SALEH, A.M.; ABDEL-MAGEED, H.M.; TAYEL, S.A.; EL-NABRAWI, M.A.;FAHMY, A.S. 2010. Characterization of Mucor racemosus lipase with potential application for the treatment of cellulite. Process Biochemistry, 46: 642-648
HASAN, F.; SHAH, A.A.; HAMEED, A. 2009. Methods for detection and characterization of lipases: A comprehensive review. Biotechnology Advances, 27: 782–798.
