ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: AVALIAÇÃO DO RENDIMENTO E MOBILIDADE DOS GLICOSAMINOGLICANOS NA CARTILAGEM ARTICULAR DE RATOS E HUMANOS
AUTORES: SANTOS, N.G (UECE) ; NUNES, R.M (UFC) ; LEITE, A.C.R.M (UFC) ; PINTO, A.C.M.D (UFC) ; TEOTONIO, M.A.A (UFC) ; ROCHA, F.A.C (UFC)
RESUMO: Na osteoartrite (OA), há quebra de proteoglicanos da cartilagem articular e liberação
de proteínas e glicosaminoglicano (GAGs). Com nossa experiência na degradação de
cartilagem, decidiu-se quantificar e avaliar mobilidade dos GAGs da cartilagem
articular humana e calcular o rendimento em ratos e humanos. Transecção do ligamento
cruzado anterior (TLCA) foi feita em ratos, seguida pela coleta da cartilagem.
Cartilagens humanas de fratura ou OA foram removidas. Nos animais OA 28 dias, houve
redução do rendimento (P<0,05). Em humanos, não ocorreu essa diferença. Houve menor
mobilidade do condrotin-sulfato da cartilagem artrósica. Conclui-se que animais
submetidos à TLCA apresentam menor rendimento, o que não ocorre em humanos. O padrão de
mobilidade dos GAGs se assemelha em ratos e humanos.
PALAVRAS CHAVES: cartilagem, glicosaminoglicanos, osteoartrite
INTRODUÇÃO: Definida como uma estrutura resistente e elástica recobrindo as superfícies ósseas
articulares, a cartilagem articular é um tecido avascular desprovido de nervos e com
células esparsas (condrócitos) envolvidas por uma matriz extracelular complexa e rica
em água. Essa matriz é constituída principalmente por colágenos (tipos II, IX e XI) e
proteoglicanos (PGs) responsáveis pela resistência e elasticidade da cartilagem,
respectivamente (FREYRIA & MALLEIN-GERIN, 2011). Os glicosaminoglicanos (GAGs) são
polissacarídeos lineares constituídos por resíduos repetidos de dissacarídeos de
ácido urônico (geralmente ácido D-glicurônico ou L-idurônico) e N-acetil-glicosamina
ou N-acetil-galactosamina (MOTTA, 2011) sintetizados pelos condrócitos que, ao se
ligarem covalentemente a uma cadeia central de proteína, formam os PGs. Na cartilagem
normal, a interação agrecan (o PG mais abundante da cartilagem articular), ácido
hialurônico e colágeno dá suporte à cartilagem, enquanto o condroitin-sulfato (CS)
(dissacarídeo formado pela N-acetil galactosamina e ácido glicurônico) do agrecan
colabora para resistência à compressão. Em doenças como a osteoartrite (OA), há uma
quebra dos PGs com liberação de proteínas e GAGs para o fluido articular. Em estudo
do nosso grupo, foi padronizado um método de quantificação simples e direto de GAGs
da cartilagem para avaliação do dano articular em ratos (CASTRO et al., 2006).
Baseada na nossa experiência com o método de quantificação e a iniciação dos estudos
com cartilagem humana em nosso laboratório, decidiu-se quantificar os GAGs da
cartilagem humana, bem como calcular o seu rendimento, comparando-o com o de ratos. O
presente estudo avaliou ainda a qualidade dos GAGs de seres humanos através do perfil
de mobilidade.
MATERIAL E MÉTODOS: Foram utilizados ratos Wistar (n = 8) e amostras de 20 pacientes (ambos os sexos e
faixa etária de 60-92 anos). Ambos os projetos foram aprovados pelo Comitê de Ética
em Experimentação Animal (CEPA) - UFC e Comitê de Ética em Pesquisa do HUWC – UFC.
Antes de qualquer procedimento, o TCLE foi devidamente assinado. Ratos foram
submetidos à transecção do ligamento cruzado anterior (TLCA) e sacrifício após 28 ou
70 dias. Grupo sham foi submetido à cirurgia sem TLCA. Animais naive não foram
submetidos a qualquer procedimento cirúrgico (CASTRO et al., 2006). A degradação da
cartilagem de ratos e humanos foi iniciada com a sua remoção cirúrgica, pesagem e
secagem. Em seguida, as amostras foram homogeneizadas em acetona e submetidas à
PROLAV 750R (complexo enzimático) em tampão Tris-HCl/NaCl, sendo digeridas em banho-
maria (56oC) por 48 h. A mistura reacional obtida foi mantida em banho-maria (37oC)
por 30 min, adicionado, em seguida, ácido tricloroacético, agitada a 4oC por 15 min e
centrifugada. Em seguida, foi adicionado etanol ao sobrenadante e a mistura foi
mantida overnight a 4oC e novamente centrifugada. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado (GAG) foi dissolvido em água destilada, separado por eletroforese em gel
de agarose (0,6%) e corado com azul de toluidina (0,1%). Em seguida, foi feita a
eletroforese em gel de poliacrilamida (6%) dos GAGs extraídos e coloração com azul de
toluidina (0,1%). Os géis de agarose e poliacrilamida foram escaneados para
determinação da densidade óptica e mobilidade relativa, respectivamente. Os dados
foram expressos como média ± ep.m. e submetidos a ANOVA seguida de teste de Tukey.
Para a mobilidade, os dados foram submetidos ao teste t de Student. Foi considerado
P<0,05.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A figura 1 mostra o rendimento da degradação da cartilagem articular em ratos e seres
humanos. Animais naive apresentaram um rendimento menor e significativo comparado aos
demais grupos. Considerando-se que esses animais são os mais jovens, pode-se sugerir
que a idade interfere no rendimento. De fato, o processo de envelhecimento da
cartilagem pode torná-la mais susceptível à degradação enzimática. Na OA, os animais
do grupo 28 dias mostraram uma redução significativa do rendimento comparado ao
respectivo grupo sham. Esse fato é intrigante, já que dados anteriores do nosso grupo
mostraram aumento de GAGs em animais do grupo OA 70 dias (SILVA JR et al., 2009),
particularmente se considerarmos que o rendimento entre os grupos sham e OA 70 dias
não diferiu. Corroborando com essa suposição, Brandt (1991) mostrou aumento de PGs em
cachorros submetidos à TLCA, mantido por 64 semanas. O que se poderia supor é que,
embora ocorra aumento de GAGs na OA, esses GAGs podem estar alterados e isso pode
interferir na susceptibilidade à degradação. Em humanos, não houve diferença
significativa do rendimento entre o grupo fratura e OA. É possível que a diferença
entre o tamanho das amostras tenha contribuído para esse resultado. Quanto à
qualidade dos GAGs, os resultados mostraram uma menor mobilidade relativa do CS da
cartilagem artrósica em relação à fratura, sugerindo que o CS na OA apresenta maior
peso molecular (Figura 2). Colaborando com esse achado, nosso grupo mostrou uma
associação entre o aumento da quantidade e peso molecular do CS nas amostras de
cartilagem do de ratos submetidos à TLCA, sugerindo alterações qualitativas e
quantitativas da cartilagem artrósica (SILVA JR ET al., 2009).
CONCLUSÕES: Animais submetidos à TLCA apresentam menor rendimento no processo de degradação da
cartilagem articular. Em seres humanos, essa redução não ocorre. Nas cartilagens
humanas artrósicas, o padrão de mobilidade dos GAGs se assemelha ao dos animais
submetidos à TLCA.
AGRADECIMENTOS: Funcap e CNPq
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: CASTRO, R.R.; CUNHA, F.Q.; SILVA JR, F.S.; ROCHA, F.A.C. A quantitative approach to measure joint pain in experimental osteoarthritis - evidence of a role for nitric oxide. Osteoarthritis and Cartilage, v. 14, p. 769-776, 2006
SILVA FS, J.R; YOSHINARI N.H; CASTRO R.R; GIRÃO V.C; POMPEU M.M; FEITOSA J.P; ROCHA F.A. Combined glucosamine and chondroitin sulfate provides functional and structural benefit in the anterior cruciate ligament transection model. Clinrheumatol. 2009 feb;28(2):109-17
BRANDT K.; BRAUNSTEIN E.M.; VISCO D.M.; O’CONNOR B.; HECK D.; ALBERT M. Anterior (cranial) cruciate ligament transection in the dog a bona fide model of osteoartritis, not merely of cartilage injury and repair. J Rheumatol 1991;18:436-46.
FREYRIA A.M.; MALLEIN-GERIN F. Chondrocytes or adult stem cells for cartilage repair: The indisputable role of growth factors. Injury 2011, [7], pp 1-7.
MOTTA, VALTER T. Bioquímica. Editora Medbook, 2ª ed., cap 5, pp. 105-124, 2011.
