ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: COMPARAÇÃO DA IMOBILIZAÇÃO DA LIPASE DE Botryosphaeria ribis EC-01 EM CARVÃO ATIVADO GRANULAR DE COCO E MADEIRA
AUTORES: ANDRADE, M.M. (UEL) ; BOFINGER, M.R (UEL) ; OLIVEIRA, B.H. (UNESP) ; GUEDES, C. L. B. (UEL) ; LIMA, V.M.G. (UNESP) ; BARBOSA, A.M (BRI) ; DEKKER, R.F.H (BRI) ; DALL'ANTONIA, L.H. (UEL)
RESUMO: Um carvão ativado obtido de coco (LB) e outro de madeira (LC) foram comparados como suporte para imobilizar a lipase extracelular de Botryosphaeria ribis, obtida quando o fungo foi cultivado em 1 % (m/v) de torta de soja em água destilada, por 5 dias a 180 rpm e 28 ºC. A imobilização das concentrações de lipase (1, 2 e 3 % v/v) foi desenvolvida a 5 e 25ºC nos tempos de retenção de 30 min. a 16 h. A análise de variância e teste de Tukey, ao nível de 5%, indicou que em 5ºC ocorreu a maior adsorção da lipase em ambos os suportes avaliados. Não houve diferença significativa quanto ao tempo de adsorção, porém esta foi co-dependente da concentração da enzima, visto que em 30 min 100% da solução de lipase a 3 % (m/v) foi imobilizada no suporte LB.
PALAVRAS CHAVES: imobilização de lipase, carvão ativado, botryosphaeria ribis
INTRODUÇÃO: Adsorventes de carvão ativado são amplamente empregados para purificação de produtos como açúcar refinado, processamento de alimentos, tratamento de água e efluente e remoção de orgânicos voláteis nos processos industriais gasosos por ser um poderoso adsorvente. Sua grande área superficial e volume de poro permitem a remoção de contaminantes em fase líquida, incluindo compostos orgânicos, íons de metais pesados e corantes (HSIEH e TENG, 2000). Entretanto, a sua utilização se transforma em uma opção vantajosa pelo baixo custo de produção, comparados com outros materiais utilizados na imobilização de enzimas. A principal desvantagem do uso de lipases na indústria é o custo desta enzima. Uma alternativa viável é imobilizá-la, o que permite a sua recuperação e reutilização (NOUREDDINI et al., 2005). A adsorção constitui um dos métodos mais comuns e apresenta baixo custo e utiliza condições experimentais mais brandas. A enzima é imobilizada em suporte sólido, geralmente hidrofóbico e não compete com a água disponível no meio reacional, por ligações de baixa energia como a de Van der Waals. O sucesso e eficiência deste processo dependem de vários parâmetros como o tamanho da proteína, área superficial do adsorvente e, principalmente, a porosidade e tamanho dos poros (VILLENEUVE et al., 2000). Neste trabalho foram comparados dois tipos de carvão ativado, sendo um obtido de coco e outro de madeira, para imobilizar a lipase extracelular produzida pelo fungo Botryosphaeria ribis EC-01, quando este foi cultivado em torta de soja 1 % (m/v) em água destilada sob fermentação submersa. O tempo de adsorção da lipase aos substratos, bem como diferentes concentrações da solução de lipase também foram avaliados.
MATERIAL E MÉTODOS: O B. ribis foi mantido em batata-dextrose agar a 4 ºC e transferido para placas com meio mínimo de Vogel, glucose 1% (m/v) e agar 2% (m/v) por 5 dias a 28 ºC. Quatro esferas de ~0,7 cm de diâm. foram inoculadas em cada frasco de Enlenmeyer (125 mL) com 25 mL de água destilada e 1 % (m/v) de torta de soja. Foram desenvolvidos 15 cultivos, em paralelo, em agitador rotatório a 180 ºC a 28 ºC por 5 dias. Os cultivos foram interrompidos e centrifugados. Os sobrenadantes foram filtrados em papel de filtro, a vácuo e utilizados como solução de enzima. A imobilização em carvão ativado foi realizada colocando-se em contato 1 g do carvão ativado de coco (GAC-LB) ou madeira (GAC-LC) Crosscarbo 12 x 40 (Cross Filter Brasil Ltda.), 50 mL de sol. enzimática em tampão fosfato 0,05 M pH 8,0, nas concentrações de 1, 2 e 3% (v/v) com atividade enzimática de 5,4; 14,2 e 20,5 U/gsuporte, respectivamente. A mistura foi mantida em agitador orbital a 150 rpm nas temperaturas de 5º e 25°C por 30, 60, 90 minutos e 3, 6 e 16 h. O derivado imobilizado foi lavado duas vezes com água destilada e seco a vácuo. A quantidade de enzima imobilizada foi determinada pelo decréscimo do teor protéico após o contato da solução enzimática com o suporte (NAKANISH et al., 2001). A concentração de proteínas foi determinada no sobrenadante pelo método Bradford (1976). A atividade de lipase foi determinada por espectrofotometria, utilizando-se o palmitato de p-nitrofenila como substrato a pH 8,0 e 55 ºC, por 2 min., a 410 nm (MESSIAS et al., 2009). A unidade de lipase foi definida como a liberação de 1 µmol de p-NPP por min. por mL da solução de enzima. Os resultados foram avaliados estatisticamente por ANOVA e teste de Tukey ao nível de 5% de significância (OriginPro v. 8.0, OriginLab Corporation USA).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A média de adsorção da lipase de Botryosphaeria ribis foi maior (p<0,05) a 5 ºC (Figura 1) em ambos os suportes quando comparada com a média obtida a 25 ºC (Figura 2). O suporte LB, em alguns experimentos proporcionou maior rendimento de imobilização, porém na maioria, a diferença não foi significativa. Observou-se que a adsorção foi co-dependente da concentração de lipase adicionada, ou seja, quando a concentração utilizada foi mais baixa (1%), não houve diferença significativa entre os suportes, entretanto, com maiores concentrações de lipase (2 e 3 %) houve diferença. O tempo de contato enzima/substrato não foi significativo para alterar o padrão de imobilização desta lipase. Portanto um tempo de imobilização reduzido (30 min) foi suficiente para adsorver 100% da lipase (LB), independentemente da concentração da enzima. Kaewthong et al. (2005) obtiveram 0,36 % de imobilização da lipase de Pseudomonas sp. em 1h, utilizando uma solução enzimática de aproximadamente 1000 U/gsuporte. Por outro lado, Menoncin et al. (2009) imobilizaram 30,4 % de uma lipase de Penicillium verrucosum em 2h a 5 ºC. Uma lipase comercial de Candida antarctica B foi imobilizada em carvão ativado granular, sintetizado a partir de casca de coco, e também em carvão ativado comercial de tecidos, tendo sido obtido uma imobilização de até 95% a 25ºC (NARANJO et al., 2010). Portanto, a imobilização da lipase de B. ribis obtida neste trabalho foi bastante eficiente no carvão LB em 30 minutos a 5 ºC quando comparado com os resultados obtidos na literatura cientifica.
CONCLUSÕES: A temperatura de 5ºC proporcionou maior imobilização da lipase do Botryosphaeria ribis. O tempo de contato enzima/substrato não foi significativo para alterar o padrão de imobilização da enzima, embora tenha sido demonstrada co-dependencia da concentração da solução de lipase. O suporte LB foi selecionado para os próximos experimentos de aplicação desta lipase imobilizada.
AGRADECIMENTOS: CAPES, CNPq, Fund. Araucária –PR (Proj. 15285 Cham. 14/2008), FAPESP (Proc. 2010/07998-9) e PROPPG-UEL (Proj: 062446).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BRADFORD M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. 1976. Analytical Biochemistry, 72: 248-254.
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KAEWTHONG, W.; SIRISANSANEEYAKUL, S.; PRASERTSAN, P.; H-KITTIKUN, A. Continuous production of monoacylglycerols by glycerolysis of palm olein with immobilized lipase. 2005 Process Biochemistry, 40: 1525-1530.
MENONCIN, S.; DOMINGUES, N.M.; FREIRE, D.M.G.; OLIVEIRA, J.V.; Di LUCCIO, M.; TREICHEL, H.; OLIVEIRA, D. Imobilização de lipases produzidas por fermentação em estado sólido utilizando Penicillium verrucosum em suportes hidrofóbicos. 2009. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 29: 440-443.
MESSIAS, J.M.; COSTA, B.Z.; LIMA, V.M.G; DEKKER, R.F.H.; REZENDE, M.I.; KRIEGER, N.; BARBOSA, A.M. 2009. Screening Botryosphaeria species for lipases: Production of lipase by Botryosphaeria ribis EC-01 grown on soybean oil and other carbon sources. Enzyme and. Microbial Technology, 45: 426-431.
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NARANJO, J.C.; CÓRDOBA, A.; GIRALDO, L.; GARCÍA, V.S.; MORENO-PIRAJÁN, J.C. Lipase supported on granular activated carbon and activated carbon cloth as a catalyst in the synthesis of biodiesel fuel. 2010. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 66: 166-171.
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