ÁREA: Química Analítica
TÍTULO: DESENVOLVIMENTO DE UMA ROTINA AUTOMATIZADA DE ANÁLISE EM FLUXO CONTÍNUO (FIA) PARA DETERMINAÇÃO DO POTENCIAL ANTIOXIDANTE EM EXTRATOS VEGETAIS USANDO FE3+ COMO AGENTE OXIDANTE
AUTORES: BOLSON, M.A. (INPA) ; NEVES, T. L. (INPA) ; SARGENTINI, E. C. P. (UEA) ; SARGENTINI JUNIOR, E. (INPA)
RESUMO: A constatação de que os vegetais possuem substâncias biologicamente ativas que traz benefícios à saúde ou efeitos fisiológicos desejáveis tem impulsionado estudos sobre a propriedade antioxidante e como determiná-las. O sistema de análises em fluxo contínuo (FIA) tem o objetivo de otimizar os procedimentos de análises químicas, reduzindo o envolvimento do operador, melhorando a precisão das medidas e aumentando o número de amostras que podem ser processadas por unidade de tempo sendo simples e versáteis. A proposta deste trabalho foi o desenvolvimento de uma rotina automatizada de análise em fluxo contínuo (FIA) de um método auxiliar para determinação do potencial antioxidante em extratos vegetais (chás) usando Fe3+ como agente oxidante.
PALAVRAS CHAVES: análise antioxidante, chá, fia
INTRODUÇÃO: Os antioxidantes são substâncias que em pequenas concentrações, quando comparadas com os substratos oxidáveis, retardam ou inibem significamente a oxidação destes substratos, além de agir em diferentes níveis da sequência oxidativa (Halliwell & Gutteridge, 1989; Gutteridge). O interesse pela descoberta de novos antioxidantes a partir de fonte naturais vem crescendo nos últimos anos, principalmente por prevenir e minimizar o dano oxidativo às células vivas (Pereira, 1996; Soares, 2002; Alcaraz & Carvalho, 2004). A importância da pesquisa por antioxidantes naturais tem aumentado muito nos últimos anos. A constatação de que os vegetais possuem substâncias biologicamente ativas que traz benefícios à saúde ou efeitos fisiológicos desejáveis tem impulsionado estudos sobre a propriedade antioxidante. O método submetido à automatização em um sistema FIA é baseado na redução de Fe3+ por substâncias redutoras contidas em extratos vegetais (chás). O íon Fe2+ é quantificado por técnica espectrofotométrica na faixa do visível usando o reagente 1,10-fenantrolina. O resultado pode ser expresso em função da quantidade de íons Fe2+ formada ou da equivalência com um redutor de referência. Os seguintes fatores foram considerados na escolha do Fe3+ como agente oxidante: potencial de redução, método analítico para a espécie reduzida e sua viabilidade para adaptações (Basset et al., 1981). É importante ressaltar que o procedimento não é um método analítico, mas um método indireto para quantificar a capacidade redutora de extratos vegetais (chás). Em outras palavras, o método proposto de uma rotina automatizada não identifica e quantifica substâncias redutoras, mas quantifica de forma indireta as substâncias que podem reduzir íons ferro(III) (potencial antioxidante)em determinada condição.
MATERIAL E MÉTODOS: O método proposto para a automatização foi baseado na adição de Fe3+ reduzido por agentes redutores contidos em extratos vegetais. Após esta etapa foi adicionado 1,10-fenantrolina que reage com o íon Fe2+ resultante e forma um composto denominado ferroína. Esse composto forma uma coloração de tons vermelho-amarelado que é quantificado por técnica espectrofotométrica a 550 nm. A Estação de Trabalho Espectrofotométrica (SWS 100), é composta por uma unidade ótico/mecânica e por uma unidade elétrica/eletrônica que tem a habilidade de interromper o fluxo de reagentes entre cada análise sem comprometer a estabilidade. Foram usados em cada análise, 200 L de amostra, 700 L de Fe3+ (200 mg.L-1) e 900 L de 1,10-fenantrolina (0,25%). Com a mistura da amostra com o reagente Fe3+ os compostos ativos na amostra reduzem o Fe3+ para Fe2+. Essa mistura é injetada simultaneamente com os 900 L de 1,10-fenantrolina em uma bobina de reação seguindo para o detector. A Calibração do método foi feita através de padrões externos de ácido ascórbico. O Limite de Detecção e o Limite de Determinação foi de acordo Skoog et al., 2002. A avaliação do potencial antioxidante foi realizada através da medição da capacidade de seqüestro (CS) de radicais Fe3+ (Novaes, 2007). Os resultados obtidos foram expressos em equivalência com o ácido ascórbico (mg.L-1 de AA). Os extratos dos chás foram obtidos a partir de 1g de material vegetal seco por 48 horas em estufa de secagem a 50°C, sendo homogeneizado e submetido à infusão em 200 mL de água deionizada e ponto de fervura (~95°C) por 3 minutos. Após a infusão o extrato foi filtrado em filtro de papel e reservado para análise em triplicata na SWS-100.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A Fig 1 representa os resultados obtidos pelo método automatizado. Foi observado que a faixa linear dinâmica da curva de calibração abrange o intervalo de 1,3 a 100 mg.L-1 de AA. Esse intervalo foi determinado inferiormente pelo limite de quantificação e superiormente pelo R2 de forma a ajustar melhor a regressão linear, determinando assim o limite de linearidade. Após 100 mg.L-1 de AA o método não mostrou linearidade satisfatória e foi excluído da curva de calibração. Com o limite de detecção foi de 0,96 mg.L-1 de AA, o método é capaz de distinguir variações menores que 1 mg.L-1 de AA como potencial de antioxidante. As possíveis interferências causadas pelas variadas tonalidades de cor dos chás foram identificadas com a substituição dos reagentes de Fe3+ e 1,10-fenantrolina por água deionizada. Os resultados deste estudo mostraram que os extratos apresentam diferentes níveis de interferência na leitura do espectrômetro a 550 nm, mostrando que o capim-cidreira (Cymbopogon citratus Staupf) apresentou o maior nível de interferência, 4,7%, enquanto que a erva-mate (Ilex paraguariensis) o menor, 0,6% (Fig 2.a e Tab 1). Livre de possíveis interferências de cor as análises mostraram uma clara diferença do potencial antioxidante dos diferentes extratos testados (Fig 2.b, Tab 1). A erva-mate (Ilex paraguariensis) apresentou maior potencial, 361,5 mg.L-1 de AA, enquanto que o capim-cidreira apresentou menor potencial, 41,3 mg.L-1 de AA. Os extratos de plantas regionais apresentaram também bons resultados. O crajiru (Arrabidae chira) apresentou potencial no nível da erva-mate, 326,6 mg.L-1 e a pata-de-vaca apresentou um menor potencial, 48 mg.L-1, mantendo-se ao nível dos demais extratos.
CONCLUSÕES: O método automatizado de avaliação de potencial antioxidante proposto, utilizando a estação espectrofotométrica FEMTO SWS-100 se mostrou satisfatório em análise de extratos aquosos. Embora o limite de detecção apresentou valor alto quando se comparado com outros métodos analíticos. Em termos de tempo de análise, para cada amostra, demorou-se no total cerca de 8 minutos, incluindo no processo a inibição da interferência de cor. Em comparação, outros métodos de determinação de potencial antioxidantes podem ultrapassar 30 minutos cada determinação (Miliauskas et. al.,2004; Novaes, 2007).
AGRADECIMENTOS: FUNASA, CNPq
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: ALCARAZ, M. J.; CARVALHO, J. C. T. 2004. Flavonóides como agentes inflamatórios. In: Carvalho,J.C.T., fitoterápidos anti-inflamatórios: aspectos químicos, farmacológicos e aplicações terapêuticas, Ribeirão Preto, SP – Tecmedd, 79-97p.
BASSETT, J.; DENNEY, R. C.; JEFFERY, G. H. E MENDHAM, J. 1981. Vogel: Análise Inorgânica Quantitativa. Traduzido por Aïda Espinola. 4 ed. Rio de Janeiro: Guanabara,. Tradução de: Vogel’s Textbook of Quantitative Inorganic Analysis.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M.C. 1989. Free radicals in Biology and Medicine. Oxford: Clarendon Press, 543pp.
NOVAES, J. A. P. 2007. Desenvolvimento e validação de método para quantificação da capacidade redutora de extratos vegetais secos. Manaus, Dissertação de mestrado. Universidade do Estado do Amazonas.
PEREIRA, B.; COSTA ROSA, L. F. P. B.; BECHARA, E. J. H.; CURI, R. 1996. Antioxidant enzymes in the lymphoid organs and macrophages of rats trained to moderate exercise. Cienc. Cult., São Paulo, 48 (43): 46p.
SOARES, S. E. 2002. Ácidos fenólicos como antioxidantes. Revista de Nutrição. 15 (1): 71-81p.
SKOOG, DOUGLAS A.; HOLLER, JAMES F; NIEMAN, TIMOTHY A. 2002. Princípios de análise instrumental. 5 ed. Porto Alegre: Bookman. 27-32p.
