ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: DETERMINAÇÃO DE CÁLCIO EM PROTEÍNAS DO TECIDO HEPÁTICO DE TILÁPIA DO NILO
AUTORES: MACHADO, A.U. (UNESP - IBB) ; CARVALHO, T.S. (UNESP - IBB) ; CAVECCI, B. (UNESP - IBB) ; SANTOS, F.A. (UNESP - IBB) ; MORAES, P.M. (UNESP - IBB) ; NEVES, R.C.F. (UNESP - FMVZ) ; LIMA, P.M. (UNESP - FMVZ) ; PADILHA, P.M. (UNESP; INCT)
RESUMO: A determinação quali-quantitativa de cálcio em "spots" de proteínas do tecido hepático de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) foi feita por Fluorescência de Raios-X de Radiação Síncroton (SR-XRF) e Espectrometria de Absorção Atômica em Chama (FAAS), após a separação das proteínas por Eletroforese Bidimensional em Gel de Poliacrilamida (2D-PAGE). Os espectros de fluorescência obtidos indicaram a presença de cálcio em doze spots protéicos das amostras de fígado. Os íons metálicos detectados nas amostras estão distribuídos principalmente em proteínas de massa molar menor que 40 kDa e com pI entre 4,7 e 9,4. As concentrações de cálcio ligado às proteínas foram determinadas por FAAS após a mineralização ácida dos spots protéicos e apresentaram valores de 1,08 a 5,80 mg g-¹.
PALAVRAS CHAVES: proteínas, nutrição de peixes, 2d-page.
INTRODUÇÃO: A produção mundial de pescado procedente da aquicultura é estimada em 47 milhões de toneladas, das quais 28 milhões são decorrentes do cultivo em águas continentais, principalmente dos países tropicais, como o Brasil. Das espécies ícticas criadas em ambientes tropicais de água doce destacam-se as tilápias com uma produção mundial que supera dois milhões de toneladas (SA et al., 2005). O estudo das proteínas presentes em diferentes tecidos da tilápia poderá trazer informações importantes para os pesquisadores que trabalham com essa espécie, já que as metaloproteínas e os íons metálicos ligados às proteínas representam uma grande porção do número total de proteínas (VOET et al., 2002). É consenso a fundamental importância dos íons metálicos, pois eles são essenciais como componentes estruturais e em processos vitais, podendo atuar como agentes sinalizadores, catalisadores, ou ainda alterar a expressão gênica (ANDERSON et al., 1988; SZPUNAR, 2004). Com base no exposto, o presente trabalho teve como objetivo a investigação qualitativa e quantitativa do cálcio em spots de proteínas das amostras de fígado de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) por Fluorescência de Raios-X de Radiação Síncrotron e Espectrometria de Absorção Atômica em Chama, após separação por eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida.
MATERIAL E MÉTODOS: As amostras de tecido hepático foram maceradas em água deionizada e centrifugada em centrífuga refrigerada e tratadas com kits para remoção de albumina. Posteriormente, as proteínas presentes na amostra foram precipitadas com acetona na proporção 1:4. Os precipitados foram solubilizados em tampão específico e aplicados em fitas de IOF com gel pré-fabricado com anfólitos imobilizados (pH 3 a 10). Depois de hidratadas por 12 h as fitas foram levadas ao sistema de IOF para corrida em primeira dimensão. Após essa etapa, as fitas foram equilibradas em tampão específico por 15 minutos e aplicadas em géis de poliacrilamida a 12% m/v juntamente com padrões de massa molar, para corrida em segunda dimensão. Ao término das etapas de separação (feitas em triplicata), os spots protéicos foram fixados no gel e corados com Coomassie Blue. Em seguida, os spots foram recortados do gel e secos com lâmpada infravermelha para análise por SR-XRF com feixe de 500 µm, com leitura em dois pontos do spot e tempo de 200 segundos. Finalmente, os spots que apresentaram cálcio foram submetidos à mineralização ácida para posterior quantificação por FAAS.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A determinação qualitativa de cálcio ligado às proteínas dos spots protéicos foi feita considerando a sensibilidade da técnica SR-XRF e possibilidade de que os spots protéicos poderiam conter baixas concentrações dos íons metálicos. A Figura 1 apresenta exemplo dos espectros de fluorescência obtidos nas análises por SR-XRF dos spots protéicos.
De uma forma geral, todos os espectros de fluorescência obtidos mostraram um perfil semelhante ao espectro mostrado na Figura 1. Nesta figura, vemos que outros íons metálicos também foram detectados como: ferro, zinco e magnésio. A presença de mais de um íon metálico em spots de proteínas é aceitável, já que uma única metaloproteína ou proteína metal ligante pode ter vários sítios ativos formados por átomos de íons metálicos diferentes (SUSSULINI et al., 2007). Os valores das massas molares, pontos isoelétricos e concentrações de cálcio estão sumarizados na Tabela 1. As concentrações de cálcio determinadas nos spots protéicos permitiram calcular o número de moléculas de proteínas e o número de átomos cálcio por spots protéicos, resultados também apresentados na Tabela 1.
Com base nos resultados apresentados na Tabela 1, observa-se que os spots apresentam proteínas com massa molar menor que 40,0 kDa e pI entre 4,7 e 9,4. Considerando as concentrações de cálcio determinadas, também é possível estimar a proporção de cálcio por molécula de proteína. Por exemplo, pode-se inferir que no spot 2F que cada molécula de proteína tenha aproximadamente dois átomos de cálcio. Utilizando-se esse raciocínio, pode-se inferir que as demais proteínas dos spots tenham aproximadamente de um e dois átomos de cálcio.
CONCLUSÕES: A utilização da eletroforese 2D-PAGE na investigação de metaloproteínas permitiu o fracionamento das proteínas do tecido hepático de tilápia do Nilo. A boa correlação obtida nas repetições do gel indicou que este procedimento de extração foi eficiente na preservação da estrutura metal-proteína, permitindo assim o mapeamento de cálcio nos spots protéicos por SR-XRF e sua determinação quantitativa por FAAS. Os resultados obtidos permitiram estimar que as proteínas dos spots protéicos estudados apresentam proporções de um a dois átomos de cálcio por molécula de proteína.
AGRADECIMENTOS:
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: ANDERSON, L.; DEBBLE, M.V.; TURKKI, P.R.; MITCHELL, H.S.; RYNBERGEN, H.J. 1988. Nutrição, 17ª ed., Rio de Janeiro: Ed. Guanabara, 737p.
SA, M.V.C.; PEZZATO, L.E.; BARROS, M.M.; PADILHA, P.M. 2005. Relative bioavailability of zinc in supplemental inorganic and organic sources for Nile tilapia Oreochromis niloticus fingerlings. Aquacult. Nutr. 11: 273-281.
SUSSULINI, A.; GARCIA, J. S.; ARRUDA, M. A. Z. 2007. Microwave-assisted decomposition of polyacrylamide gels containing metalloproteins using mini-vials: An auxiliary strategy for metallomics studies. Analytical Biochemistry, 361: 146-148.
SZPUNAR, J. 2004. Metallomics: a new frontier in analytical chemistry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 378: 54-56.
VOET, D.; VOET, J.G.; PRATT, C.W. 2002. Fundamentals of biochemistry. Upgrade Edition, John Wiley & Sons, Inc., 931p.
