ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: PRODUÇÃO DE PROTEASE E BETA-LACTAMASE POR BACTÉRIAS HETEROTRÓFICAS ISOLADAS DE AMBIENTES DE MINA
AUTORES: RODRIGUES, V. D. (UNICAMP) ; HENAO, D. M. O. (UNESP) ; STOPPE, N. C. (UNICAMP) ; PINA, P. (VOTORANTIM) ; OTTOBONI, L. M. M. (UNICAMP)
RESUMO: Neste estudo foi investigado a produção das enzimas beta-lactamase e protease por
linhagens de bactérias heterotróficas isoladas de ambientes de mina de cobre. A
produção das enzimas foi determinada em meio de cultivo sólido por mudança na
intensidade da cor ou pela formação de halos no meio. Das 50 linhagens avaliadas, 26
foram positivas para ambos os testes, 37 foram positivas para beta-lactamase e 31
apresentaram atividade proteolítica.
PALAVRAS CHAVES: bactérias heterotróficas, protease, beta-lactamase
INTRODUÇÃO: Ambientes extremos são fontes para o isolamento de microrganismos que são capazes de
expressar atividade enzimática extracelular e, para tanto, são utilizados na
prospecção de compostos de interesse biotecnológico e farmacacológico (ROTHSCHILD &
MANCINELLI, 2001). A classe dos antibióticos beta-lactâmicos, que inclui as
cefalosporinas, monobactans, penicilinas e carbapenemas, é amplamente utilizada no
tratamento de inúmeras doenças infecciosas (POOLE, K., 2004). No entanto, devido ao
aumento da resistência dos microrganismos aos antibióticos, a busca por novos
compostos mais eficazes se faz necessária. Enzimas isoladas de microrganismos
extremófilos têm apresentado características interessantes, como a termoestabilidade,
resistência a desnaturantes químicos, solventes orgânicos e pH extremos (LORENZ &
ECK, 2005). Várias enzimas isoladas de microrganismos extremófilos vêm sendo
utilizadas na produção de detergentes, cosméticos, processamento de alimentos e
outros (VAN DEN BURG, 2003). Entretanto, até o momento enzimas isoladas de
micorganismos presentes em minas não foram exploradas em nível de utilização
industrial. Assim sendo, este estudo objetiva avaliar a atividade de produção das
enzimas beta-lactamase e protease em linhagens de bactérias isoladas de ambientes de
mina.
MATERIAL E MÉTODOS: A partir de três amostras distintas da mina de Sossego (Canaã dos Carajás) foram
isoladas 50 linhagens de bactérias heterotróficas. A triagem para a detecção das
enzimas beta-lactamase e protease foi realizada a partir das amostras SO5, SO6 e
SO7. Antes dos experimentos de seleção as bactérias foram inoculadas em 2 mL de meio
LB líquido, cultivadas por 16 h a 37°C e, posteriormente, transferidas para placas de
Petri contendo 20 mL do meio LB sólido. As placas foram mantidas a 37°C. A detecção
de beta-lactamases foi realizada a partir de discos de cefinase (BD Diagnostic
Systems)umedecidos com água estéril. Foram retiradas colônias das placas com meio
sólido e, em seguida, foi realizado um esfregaço. Para a verificação da produção de
enzimas proteolíticas foi adicionado ao meio LB sólido 1% de leite em pó desnatado e
inoculados 2 µL de cada linhagem de bactéria cultivada durante a noite. A detecção da
atividade de beta-lactamase baseou-se na mudança da coloração de amarelo para
vermelho dos discos de cefinase. De acordo com a intensidade da cor dos discos foram
atribuídos valores, de 0 a 3, sendo o último correlacionado à maior produção da
enzima (figura 1). A atividade proteolítica foi determinada pela formação de halos
transparentes gerados pela hidrólise da caseína do leite apresenta na figura 2 (a) e
a figura 2 (b) mostra o caso negativo para a atividade proteolítica.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Trinta e sete linhagens foram capazes de hidrolisar a ligação amido no anel beta-
lactâmico, sendo que 40,82% pertenciam a amostra SO5, 28,57% a amostra SO6 e 30,61% a
amostra SO7. As bactérias capazes de inativar o anel beta-lactâmico podem estar
produzindo metabólitos secundários e podem ser resistentes aos antibióticos beta-
lactâmicos. Em relação à produção de enzimas proteolíticas, 31 linhagens foram
positivas (figura 2 (a)), das quais 41,11% pertenciam a amostra SO5, 50,47% a amostra
SO6 e 8,24% a amostra SO7. Segundo JOHNSON (2001), em ambientes de mina, as bactérias
heterotróficas parecem estar associadas aos microrganismos quimiolitotróficos. Estes,
por sua vez, são mais sensíveis às substâncias orgânicas e, por isso, dependem da
associação com as bactérias heterotróficas, pois elas detoxificam o ambiente, pois
utilizam os compostos orgânicos produzidos por organismos autotróficos. Assim, uma
provável explicação para a alta quantidade de linhagens positivas para a protease
pode estar relacionada ao processo da ciclagem de nutrientes.
CONCLUSÕES: Para a maioria das linhagens de bactérias avaliadas foi observada a capacidade de
produção das enzimas beta-lactamase e/ou protease, o que demonstra que microrganismos
isolados de ambientes extremos podem ser bastante promissores em relação à capacidade
de produzirem compostos de interesse biotecnológico.
AGRADECIMENTOS: Capes, CNPq (processo nº 550240/2010-1), Vale.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: JOHNSON, D. B. 2001. Importance of microbial ecology in the development of new mineral technologies. Hydrometallurgy 59: 147-157.
LORENZ, P.; ECK, J. 2005. Metagenomics and industrial applications. Nat Rev Microbiol 3: 510-516.
POOLE, K. 2004. Resistance to ß-lactam antibiotics. Cellular and Molecular Life Sciences 61(17): 2200-2223.
ROTHSCHILD L. J.; MANCINELLI, R. L. 2001. Life in extreme environments. Nature 409: 1092-1101.
VAN DEN BURG, B. 2003. Extremophiles as a source for novel enzymes. Curr Opin Microbiol 6(3): 213-218.
