ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: DETECÇÃO DE SIDERÓFOROS A PARTIR DE BACTÉRIAS ISOLADAS DE MINA DE COBRE
AUTORES: RODRIGUES, V. D. (UNICAMP) ; HENAO, D. M. O. (UNESP) ; STOPPE, N. C. (UNICAMP) ; PINA, P. (VOTORANTIM) ; OTTOBONI, L. M. M. (UNICAMP)
RESUMO: Neste trabalho foi investigada a capacidade de produção de sideróforo por linhagens de
bactérias heterotróficas isoladas de mina de cobre. Para este fim, foi utilizado o
teste com o meio overlay CAS em placas. Foram analisadas 64 linhagens, a partir de
quatro amostras ambientais distintas, sendo que mais de 95% das linhagens foram
positivas para catecolato, carboxilato e/ou hidroxamato.
PALAVRAS CHAVES: mina de cobre, bactérias heterotróficas, sideróforo
INTRODUÇÃO: Os microrganismos representam um importante grupo para a produção de compostos
biologicamente ativos, com aplicações na agricultura, na indústria e farmacêutica. Na
biomineração, os microrganismos são utilizados para a extração de metais (RAWLINGS &
JOHNSON, 2007). Em ambientes de mina a concentração de metais é elevada. No entanto,
a solubilidade de ferro no meio é baixa, prejudicando os microrganismos que
necessitam este metal (NEILANDS, 1995). Alguns microrganismos desenvolveram um
sistema de transporte, constituído por moléculas de baixa massa molecular, que possui
elevada afinidade pelo ferro, chamados de sideróforos (NEILANDS, 1995). De acordo com
a natureza química do sítio de ligação ao ferro, os sideróforos podem ser
classificados em três classes primcipais: hidroxamato, catecolato ou carboxilato
(WINKELMANN, 2002). Os sideróforos produzidos pelos microrganismos podem ser
utilizados em processos de biorremediação, no qual os solos poluídos são
descontaminados após o metal pesado ser quelado com o sideróforo (BRAUD et al.,
2006). Uma outra aplicação dos sideróforos pode estar associada à biomineração, pois
Acidithiobacillus ferrooxidans, um dos principais microrganismos litotróficos
envolvidos neste processo, é incapaz de produzir sideróforo. Assim sendo, este
trabalho teve como objetivo avaliar a capacidade de produção de sideróforo em
linhagens de bactérias heterotróficas isoladas de mina de cobre.
MATERIAL E MÉTODOS: A partir de quatro pontos distintos da mina de Sossego, localizada em Canaã dos
Carajás (Pará) foram isoladas 64 linhagens de bactérias heterotróficas. Antes dos
testes todas as vidrarias foram tratadas com HCl 6 M para que todo resíduo de ferro
pudesse ser removido. As bactérias foram inoculadas em 2 mL de meio LB líquido,
cultivadas sob privação de ferro e mantidas sob agitação a 200 rpm, 37°C por 16 h .
Para a detecção da produção de sideróforos, 10 µL da cultura de bactérias foram
aplicados em 25 mL de meio Agar Nutriente e as placas foram mantidas a 37°C por 16 h.
Posteriormente, foi aplicado sobre as placas o meio overlay CAS (SCHWYN & NEILANDS,
1987), modificado conforme a metodologia proposta por PÉREZ-MIRANDA et al. (2007),
como descrito a seguir: 60,5 mg/L de cromo azurol S, 72.9 mg/L de brometo de cetil
trimetil amônio (CTAB), 30,24 g/L de piperazina-1,4-bis (ácido 2-etanosulfônico)
(PIPES), e 1 mM de FeCl3.6H2O diluído em 10 mL de HCl 10 mM. Como agente gelificante
foi utilizado agarose 0,9% (p/v). As placas foram mantidas no escuro a 25ºC. A
detecção do sideróforo foi revelada após um período que variou de um a quatro dias.
De acordo com a coloração apresentada, os sideróforos foram classificados em três
tipos: catecol (azul para rosa); hidroxamato (azul para laranja); carboxilato (azul
para amarelo claro). Em placas sem o inóculo da bactéria, não houve alteração da cor
do meio contendo o ágar nutriente e o meio overlay CAS. Como controle negativo, foram
usadas linhagens de microrganismos cultivadas na presença de íon férrico.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Foram analisadas 64 linhagens de bactérias heterotróficas isoladas das amostras SO5,
SO6, SO7 e SO9, provenientes de mina de cobre, conforme a tabela 1. Algumas bactérias
produziram apenas um tipo de sideróforo (catecolato ou hidroxamato: figura 1 (a) e
(b), respectivamente), enquanto que outras apresentaram mais de um tipo (figura 1
(d), (e) e (f)). Não foram encontradas bactérias capazes de produzir somente o
sideróforo carboxilato, que de acordo com PÉREZ-MIRANDA et al. (2007) é o mais raro.
Este tipo de sideróforo foi produzido apenas em conjunto com os sideróforos
catecolato e/ou hidroxamato. O mecanismo de produção dos sideróforos ocorre quando a
disponibilidade de ferro no meio é baixa, como, por exemplo, no tipo de ambiente onde
as amostras foram coletadas. Neste trabalho a maioria das linhagens analisadas foi
positiva para a produção de sideróforo, sugerindo que essas bactérias podem ser
capazes de desempenhar um papel fundamental para microbiota do local. As bactérias
heterotróficas ao produzirem os sideróforos possibilitam que o ferro se torne solúvel
e com potencial de ser assimilado e incorporado ao metabolismo celular de outros
microrganismos (WANDERSMAN & DELEPELAIRE, 2004). HIDER & KONG (2010) relataram que em
solos que apresentam grande quantidade de vegetais em decomposição é normal que
muitos microrganismos produzam o sideróforo hidroxamato, ao contrário do ambiente
analisado neste estudo onde a concentração de metais é maior e a cobertura vegetal é
escassa ou ausente. No ambiente de mina analisado, o catecolato foi o tipo de
sideróforo mais produzido pelas bactérias.
CONCLUSÕES: A maioria das amostras foi positiva para a presença de sideróforos. Será dada a
continuidade da triagem funcional destes microrganismos. Os microrganismos isolados
deste tipo de ambiente estão em um nicho ecológico peculiar, no qual existe um grande
potencial para a identificação de compostos com várias aplicações para a biomineração e
biotecnologia.
AGRADECIMENTOS: Capes, CNPq (processo nº 550240/2010-1), Vale.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BRAUD, A.; JEZEQUEL, K.; LEGER, M. A.; LEBEAU, T. 2006. Siderophore production by using free and immobilized cells of two pseudomonads cultivated in a medium enriched with Fe and/or toxic metals (Cr, Hg, Pb). Biotechnology and Bioengineering 94: 1080-1088.
HIDER R. C, KONG X. 2010. Chemistry and biology of siderophores. Natural product reports 27 (5): 637-657.
NEILANDS, J. B. 1995. Siderophores – structure and function of microbial iron transport compounds. Journal of Biological Chemistry 270: 26723-26726.
PEREZ-MIRANDA, S.; CABIROL, N.; GEORGE-TELLEZ, R.; ZAMUDIO-RIVERA, L. S.; FERNANDEZ, F. J. 2007. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods 70: 127-131.
RAWLINGS, D. E. JOHNSON, D. B. 2007. Biomining. Heidelberg: Springer.
SCHWYN, B.; NEILANDS, B. 1987. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry 160: 46-56.
WANDERSMAN, C.; DELEPELAIRE, P. 2004. Bacterial iron sources: From Siderophores to Hemophores. Annual Review of Microbiology 58: 611-647.
WINKELMANN, G. 2002. Microbial siderophore-mediated transport. Biochemical Society Transactions 30(4): 691-696.
