ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: Mapeamento de zinco em spots protéicos de amostras de tecido hepático de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus)
AUTORES: CARVALHO. T. S (UNESP-BOTUCA) ; MACHADO. A. U (UNESP-BOTUCA) ; CAVECCI. B (UNESP-BOTUCA) ; GARCIA. L. A (UNESP-BOTUCA) ; SILVA. F. A (UNESP-BOTUCA) ; NEVES. R. C. F (UNESP-BOTUCA) ; LIMA. P. M. (UNESP-BOTUCA) ; SANTOS. F. A (UNESP-BOTUCA) ; PADILHA. P. M (UNESP-BOTUCA)
RESUMO: O objetivo do presente trabalho foi investigar Zn em spots protéicos de amostras de tecido hepático de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida em segunda dimensão (2D-PAGE) utilizando Fluorescência de Raios-X por Radiação Síncrotron (SR-XRF). A análise por SR-XRF indicou a presença do Zn em oito spots protéicos das amostras tecido hepático. As proteínas nas quais foram detectadas a presença de zinco apresentaram massas molares na faixa de 14 a 55 kDa e ponto isoelétrico (pI) na faixa de 4,5 a 9,7
PALAVRAS CHAVES: metaloproteínas, 2d-page, sr-xrf
INTRODUÇÃO: A determinação de íons metálicos tem sido investigada em diversas áreas de conhecimento, tais como: bioquímica, química, medicina, nutrição, toxicologia, meio ambiente, entre outras. Esses íons metálicos apresentam papel importante nos sistemas biológicos, estando ligados em sua maioria às proteínas. Devido à importância que as metaloproteínas exercem sobre as atividades biológicas dos seres vivos, uma nova área científica, denominada metalômica foi proposta recentemente e permitiu a integração de estudos tradicionalmente analíticos com estudos inorgânicos e bioquímicos [1]. O estudo das metaloproteínas presentes em diferentes tecidos de peixes poderá trazer informações importantes para a área de fisiologia e genética desses animais. A identificação qualitativa e quantitativa de íons metálicos ligados a essas metalobiomoléculas é a base para estudos com materiais biológicos de diversas naturezas [2]. Com base no exposto, o presente trabalho teve como objetivo mapear o Zn em spots protéicos de amostras de tecido hepático de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida em segunda dimensão (2D-PAGE) utilizando a fluorescência de raios-X com radiação síncrotron (SR-XRF)
MATERIAL E MÉTODOS: A amostra de fígado foi inicialmente macerada em água utilizando almofariz e pistilo. O extrato protéico obtido foi centrifugado a 13000 rpm durante cinco minutos em centrífuga refrigerada a 4ºC. Posteriormente o sobrenadante foi tratado com kit para remoção de albumina e as proteínas foram precipitadas com acetona na proporção 1:4 (amostra:acetona). Após este procedimento o precipitado protéico foi ressolubilizado em tampão (uréia 7 M, tiouréia 2 M, CHAPS 2% (m/v), anfólitos, azul de bromofenol 0,002% (m/v)) e DTT 2.8 mg. O extrado contendo as proteínas ressolubilizadas foi aplicado em fitas de focalização isoelétrica de 13 cm, com o gel pré-fabricado com anfólitos imobilizados de pH 3-10. Estas fitas foram hidratadas durante 12 horas com as amostras e em seguida levadas ao sistema de focalização isoelétrica, para corrida em primeira dimensão da eletroforese bi-dimensional. O tempo médio total das etapas foi de 4,5 horas. Na segunda dimensão, as fitas de géis obtidas foram equilibradas em tampão de equilíbrio (2% SDS, Tris-HCl 50 mM pH 8,8, Uréia 6 mol/L, Glicerol 30% (v/v) e azul de bromofenol 0,002%) em duas etapas, com DTT e iodoacetamida, durante 15 min. Em seguida, essas fitas foram aplicadas em géis de poliacrilamida a 12,5%, com padrões proteícos de massa molar conhecida. O padrão e as fitas foram selados no gel de poliacrilamida com agarose quente 0,5% (m/v) O tempo médio na separação em segunda dimensão foi de 12 horas. Os géis foram feitos em triplicata. Após as separações, as proteínas foram fixadas no gel e coradas com Coomassie Blue. Os spots foram recortados do gel, secos com lâmpada infravermelho e analisados por fluorescência de raios-X com radiação síncrotron (SR-XRF) com feixe de 500 µm, com leitura em dois pontos do spot e tempo de 200 segundos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: O número de spots protéicos nos géis foi de 505±12. A análise das repetições de géis (n=3) demonstrou uma correlação média de 66,4%. Os resultados obtidos na análise dos géis por SR-XRF indicaram a presença de zinco em 8 spots de proteínas das amostras de fígado de tilápia do Nilo. As massas molares (MM), bem como os respectivos pontos isoelétricos (pI) das proteínas que apresentaram zinco são mostrados na Tabela 1.A análises dos spots protéicos por SR-XRF (Tabela 1) revelou que das 8 proteínas encontradas nas amostras o zinco está distribuído em proteínas com massa molar menor que 50 kDa. Em Apenas um spot protéico, maior que 50 kD (55 kd), foi detectado a presença do zinco. A estimativa dos pontos isoelétricos (pI) dessas proteínas ficaram entre 4,5 e 6,7
CONCLUSÕES: Conclusões: A utilização da eletroforese bidimensional (2D-PAGE) permitiu o fracionamento das proteínas presentes em um pool de amostras de tecido hepático de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). A boa correlação obtida nas repetições dos géis possibilitou o mapeamento de zinco nos spots protéicos por SR-XRF, o que representa uma etapa inicial no estudo da metalômica dessa espécie de peixe.
AGRADECIMENTOS: Os autores agradem à FAPESP (Processo 2007/59778-0), ao CNPq/FAPESP (Processos 573672/2008-3 e 08/57805-2-INCT de Bioanalítica, LNLS, Fundibio
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: 1. GAO, Y.; CHEN, C.; ZHANG, P.; CHAI, Z.; HE, W.; HUANG, Y. Detection of metalloproteins in human liver cytosol by synchrotron radiation X-ray fluorescence after sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis. Analytica Chimica Acta, v.485, p.131-137, 2003.
2. GARCIA, J.S.; MAGALHÃES, C.S.; ARRUDA, M.A.Z. Trends in metal-binding and metalloprotein analysis. Talanta, v.69, p.1-15, 2006
