ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: Fracionamento de proteínas de plasma de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) por eletroforese bidimensional
AUTORES: MACHADO. A. U (UNESP) ; CARVALHO. T.S (UNESP) ; CAVECCI. B (UNESP) ; GARCIA. L. A (UNESP) ; SILVA. F. A (UNESP) ; NEVES.R. C. F (UNESP) ; LIMA. DE P. M (UNESP) ; SANTOS. F. A. (UNESP) ; PADILHA. P. M (UNESP)
RESUMO: O presente trabalho teve como objetivo otimizar protocolo para separação de proteínas de amostras de plasma de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) por eletroforese em gel de poliacrilamida em segunda dimensão (2D-PAGE). O programa para as separações em primeira dimensão consistiu em 4 etapas: 1) Tensão 500 V, com Acúmulo de 500 Vh; 2) Tensão 1.000 V, com Acúmulo de 800 Vh; 3) Tensão 10.000 V, com Acúmulo de 11.300 Vh; 4) Tensão 10.000 V, com Acúmulo de 3.000 Vh. O tempo médio total destas etapas foi de 4,5 h. Separação em segunda dimensão obteve em uma etapa: Tensão 90 V, corrente elétrica 25 mA, potência 100 W e com tempo médio de 12h. As condições de permitiram a obtenção de 575±13 spots protéicos, uma correlação média de 89,5%, considerando as repetições de três amostras de plasma
PALAVRAS CHAVES: proteínas, nutrição de peixes, 2d-page
INTRODUÇÃO: A produção mundial de pescado procedente da aqüicultura é estimada em 47 milhões de toneladas, das quais 28 milhões são decorrentes do cultivo em águas continentais, principalmente dos países tropicais, como o Brasil. Das espécies ícticas criadas em ambientes tropicais de água doce destacam-se as tilápias com uma produção mundial que supera dois milhões de toneladas. Nos últimos anos no Brasil ocorreu um considerável aumento na produção de tilápias, o que tem levado os pesquisadores que trabalham com aqüicultura a desenvolverem trabalhos relacionados ao comportamento, fisiologia, genética e nutrição dessa espécie de peixe [1,2]. O estudo das proteínas presentes em diferentes tecidos da espécie tilápia poderá trazer informações importantes para os pesquisadores que trabalham com essa espécie. A eletroforese é uma técnica que consiste na separação de moléculas sob influência de um campo elétrico aplicado. Dessa forma, a eletroforese tem sido comumente aplicada na separação de substâncias de natureza protéica que possam apresentar carga em função do pH do meio [3]. Nesse contexto, o desenvolvimento de protocolos de preparação de amostra para separações eletroforéticas é de fundamental importância. Com base no exposto, o presente trabalho apresenta a otimização de um protocolo de preparação de amostras de plasma para fracionamento de proteínas de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) por eletroforese bidimensional, como etapa inicial do estudo proteômica dessa espécie de peixe
MATERIAL E MÉTODOS: As amostras de plasma foram separadas do sangue por centrifugação a 13000 rpm durante 5 min em centrífuga refrigerada a 4ºC. As amostras foram tratadas com kits para remoção de albumina e as proteínas foram precipitadas com acetona na proporção 1:4 (amostra:acetona). Após este procedimento o precipitado protéico foi ressolubilizado em tampão (uréia 7 M, tiouréia 2 M, CHAPS 2% (m/v), anfólitos, azul de bromofenol 0,002% (m/v)) e DTT 2.8 mg, e aplicado em fitas de focalização isoelétrica de 13 cm, com o gel pré-fabricado com anfólitos imobilizados de pH 4 a 7. Estas fitas foram hidratadas durante 12 h com as amostras e em seguida foram levadas ao sistema de focalização isoelétrica, para corrida em primeira dimensão da eletroforese bi-dimensional. Na primeira dimensão consistiu em 4 etapas: 1) Tensão 500 V, com Acúmulo de 500 Vh; 2) Tensão 1000 V, com Acúmulo de 800 Vh; 3) Tensão 10000 V, com Acúmulo de 11300 Vh; 4) Tensão 10000 V, com Acúmulo de 3000 Vh. O tempo médio foi de 4,5 h. Na segunda dimensão, as fitas de géis obtidas foram equilibradas em tampão de equilíbrio (2% SDS, Tris-HCl 50 mM pH 8,8, Uréia 6 M, Glicerol 30% (v/v) e azul de bromofenol 0,002%) em duas etapas, com DTT e iodoacetamida, durante 15 min. As fitas foram em seguida aplicadas em géis de poliacrilamida a 10%, juntamente com padrão de massa molar (β-fosforilase (97,0 kDa), albumina (66,0 kDa), ovoalbumina (45,0 kDa), anidrase carbônica (30,0 kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa) e alfa-lactoalbumina (14,4 kDa)). O programa de separação em segunda dimensão consistiu de uma etapa com: Tensão 90 V, corrente elétrica 25 mA, potência 100 W. O tempo médio de corrida foi 12h. Todos os géis foram feitos em triplicata. Após as separações, as proteínas foram fixadas no gel e coradas com Coomassie Blue.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os géis obtidos nas três corridas de separação das proteínas da amostra de plasma são apresentados na Figura 1 (a, b e c). O resultado das análises de correlação entre as repetições dos géis, bem como a contagem de spots dos mesmos são apresentados nas Tabela 1.Nas figuras os géis de poliacrilamida 10% (m/v) de plasma de tilápia do Nilo com pI situado na faixa de 4 a 7 e massa molar de proteína na faixa de 30,0 a 97,0 kDa. Conforme mostra a Figura 1, os géis de plasma apresentaram boa resolução, o que demonstra que a separação de proteínas ocorreu de forma eficiente. Os géis mostram ainda que há uma grande diversidade de proteínas, espalhadas em todo o gel com algumas mais intensas com pI entre 5 e 6 e massa molar em torno de 70,0 kDa. A análise de correlação entre os três géis demonstrou que 89,5% das proteínas estavam presentes nos três géis, o que representa aproximadamente 515 spots de proteínas. O número médio de spots nos géis foi de 575 com um desvio padrão de 13 spots.
CONCLUSÕES: A boa correlação obtida nas repetições de géis nas separações por 2D PAGE possibilitará o início do estudo de caracterização das proteínas dos spots protéicos por espectrometria de massas por tempo de vôo acoplado à ionização dessortiva de matriz assistida por laser (MALDI-TOF-MS), etapa seguinte do estudo proteômico inicial da espécie tilápia do Nilo.
AGRADECIMENTOS: INCT Bioanalítica/UNICAMP, Campinas-SP
Fapesp- Fundo de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo
IBB- Instituto de Biociências-Dep. Quimica e Bioq
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: 1. SA, M.V.C., PEZZATO, L.E., BARROS, M.M., PADILHA, P.M. Apparent absorption of zinc from supplemental inorganic and organic sources to Nile tilapia Oreochromis niloticus juveniles. J. World Aquacult. Soc. 36, 375-383, 2005.
2. SA, M.V.C., PEZZATO, L.E., BARROS, M.M., PADILHA, P.M. Relative bioavailability of zinc in supplemental inorganic and organic sources for Nile tilapia Oreochromis niloticus fingerlings. Aquacult. Nutr. 11, 273-281, 2005.
3.GARCIA, J.S.; MAGALHÃES, C.S.; ARRUDA, M.A.Z. Trends in metal-binding and metalloprotein analysis. Talanta, v.69, p.1-15, 2006.
