ÁREA: Alimentos
TÍTULO: DETERMINAÇÃO DE RESÍDUOS DE ANTIBIÓTICOS EM LEITE POR LC-MS/MS
AUTORES: BITTENCOURT, M.S. (LANAGRO/RS) ; MARTINS, M.T. (LANAGRO/RS) ; ZANCANARO, I. (LANAGRO/RS) ; DEMOLINER, A. (LANAGRO/RS) ; BARRETO, F. (LANAGRO/RS) ; HOFF, R.B. (LANAGRO/RS)
RESUMO: O uso de antibióticos na cadeia produtiva de alimentos tem recebido atenção pelos órgãos de fiscalização. Usados na terapêutica veterinária, devem remanescer no produto abaixo do Limite Máximo de Resíduo exigido pela legislação. Dentro do Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes, torna-se importante desenvolver métodos multiresíduos em matrizes complexas. A Espectrometria de Massas é preferida devido a sua sensibilidade e especificidade. Em modo ESI+ as condições foram: 100ºC na fonte e gás de N2 a 350ºC, vazão de 350 L.h-1; fluxo de 10 µL.min-1; energia do capilar de 4 a 5kV e do cone extrator de 2 a 6V. A coluna utilizada foi SYMMETRY C18 75x4,6mm; 3,5mm e gradiente água e acetonitrila com 0,1% ác. fórmico (98:2) até 6min; (80:20)6-10min; (70:30)10-12min; (98:2)15-20min.
PALAVRAS CHAVES: multiresíduo, antibióticos, lc-ms/ms, leite.
INTRODUÇÃO: A segurança dos alimentos recai sobre o controle de diferentes tipos de contaminantes e resíduos que possam estar presentes a partir das práticas produtivas (MAURICIO et al, 2008). O uso de drogas veterinárias é regulamentado através de diversas normas, como a 2377/90/EC do Conselho de Regulamentação Européia, e no Brasil através do PNCRC - Plano Nacional de Controle de Resíduos e Contaminantes (BRASIL, 2009). Os antibióticos são amplamente utilizados no tratamento de diversas doenças no gado como a mastite e a metrite, mas podem gerar resíduos no leite, especialmente se não usados de acordo com os protocolos e desrespeitando o período de carência para obtenção do leite do animal tratado. Há relatos na literatura que o uso de antibióticos pode ser responsável pelo desenvolvimento de resistência em bactérias, bem como a hipersensibilidade em alguns indivíduos (SCHNEIDER et al, 2008). A espectrometria de massas (MS) tornou-se a técnica preferida para análise destes resíduos de fármacos veterinários em diversos alimentos (STOLKER, 2007; CHICO et al, 2008) devido a sua ótima seletividade e detecção, não necessitando de um excelente método de separação cromatográfica para a análise.
MATERIAL E MÉTODOS: Para este estudo selecionou-se 24 antibióticos de 3 diferentes classes (Sulfonamidas, Tetraciclinas, Quinolonas, incluindo as Fluoroquinolonas), baseou-se esta escolha no fato destes fármacos possuírem amplo uso veterinário. Na seqüência procedeu-se a infusão e otimização das condições de análise, tendo como base dados obtidos na literatura, utilizando individualmente cada padrão na concentração de 1mcg/mL em metanol (MeOH) com 0,1% de ácido fórmico (AF). Posteriormente preparou-se um pool desses antibióticos nas mesmas condições para o desenvolvimento do método. Utilizou-se cromatógrafo Alliance Separations Module 2695 (Waters, Milford, MA, USA) com amostrador automático, bomba quaternária, forno para coluna e sistema de desgaseificação, com Detector MS Micromass® Quatro Micro™ API (Waters, Inglaterra) com fonte API, utilizando o modo de ionização por Electrospray; detecção em modo MRM; Software MassLynx 4.1 (Waters, Inglaterra); sistema gerador de nitrogênio Peak Scientifics (Instruments Ltda., Escócia). A coluna utilizada foi SYMMETRY® C18, 75 x 4,6 mm de d.i. e 3,5 mm de tamanho de partícula (Waters, Irlanda); Sistema de purificação de água Milli-Q Plus APS Ultra, resistividade 18,2 MW cm Millipore (Bedford, MA, USA); Bomba à vácuo Tecnal TE-058 (Piracicaba, SP). Para o método MS, empregou-se a fonte de ionização à pressão atmosférica (API) no modo por electrospray (ESI). Na fonte API, a fase móvel e a amostra são ionizadas à pressão atmosférica, ocorrendo na seqüência a produção de íons do analito na fase líquida, transformando-os em íons gasosos, os quais são introduzidos no MS.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A partir da infusão e otimização das condições, foram obtidos os espectros de massas para cada uma das substâncias. As melhores condições para a fragmentação dos íons monitorados foram obtidas a uma temperatura de 100 ºC na fonte e fluxo de injeção do padrão de 10 mcL.min-1. A temperatura do gás N2 (gás de dessolvatação) foi de 350 ºC, mantida a uma vazão de 350 L.h-1 e para o cone de seleção dos íons a 50 L.h-1. A energia do capilar variou de 4 a 5 kV e para o cone extrator, de 2 a 6 V. Posteriormente, iniciou-se o desenvolvimento do método cromatográfico com variações na composição da fase móvel e fase estacionária, iniciando-se com uma eluição isocrática em H2O e 0,1% AF : MeOH e 0,1% AF (80:20), usando ácido fórmico para facilitar a ionização dos compostos. Após foi testada a substituição do MeOH por acetonitrila (ACN) também acrescida de AF 0,1%, obtendo-se uma melhor resolução cromatográfica. Entretanto, devido à baixa retenção dos analitos, optou-se pela utilização de gradiente (tabela 1), retardando o aparecimento dos picos referentes aos analitos e eluindo antes os interferentes presentes da matriz. Quanto à fase estacionária, foram testadas diversas colunas: SYNERGIÒ polar-RP (Phenomenex 150 x 3,00mm; 4 mm), LUNA® C18 (Phenomenex 100 x 2,00mm; 3 mm), SYMMETRY® C18 (50 x 2,1 mm; 3,5 mm) e a coluna SYMMETRY® C18 (75 x 4,6 mm; 3,5 mm) a qual gerou o melhor resultado, com uma separação melhor dos picos conforme o cromatograma demonstrado na figura 1.
CONCLUSÕES: As condições estabelecidas para o método de separação dos resíduos de antibióticos por LC-MS/MS foram consideradas satisfatórias. Quanto a sua quantificação, os resultados estão sendo aprimorados a fim de se obter um melhor limite de detecção, considerando que o método deve atingir pelo menos o LMR previsto na legislação para cada um dos analitos.
AGRADECIMENTOS: CNPq
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: COUNCIL REGULATION (EEC) No. 2377/90 of 26 June 1990 laying down a Community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin. Official Journal L 224, 18. 8. 1990, 1-8.
MAURICIO, A. Q.; LINS, E. S.; ALVARENGA, M. B. A national residue control plan from the analytical perspective – The Brazilian case. Analytica Chimica Acta, In Press 2009.
BRASIL, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, Secretaria de Defesa Agropecuária, Instrução Normativa N° 42/1999.
PROGRAMA DE CONTROLE DE RESÍDUOS PARA DROGAS VETERINÁRIAS (PNCRC). Diário Oficial da União, Nº 100, 28/05/2009 - ISSN 1677-7042
SCHNEIDER, MJ, MASTOVSKA K, LEHOTAY SJ.A, LIGHTFIELD, A, KINSELLA, B E SHULTZ, C. Comparison of screening methods for antibiotics in beef kidney juice and serum. Analytica Chimica Acta, 2008 – Article in press.
CHICO, J.; RÚBIES, A.; CENTRICH, F.; COMPANYÓ, R.; PRAT, M.D.; GRANADOS, M. High-throughput multiclass method for antibiotic residue analysis by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, v.1213, p.189-199, 2008.
STOLKER, A. A. M.; ZUIDEMA, T.; NIELEN, M. W. F. Residue analysis of veterinary drugs and growth-promoting agents. Trends in Analytical Chemistry, Vol. 26, Nº 10, 2007.
