ÁREA: Química Analítica
TÍTULO: VALIDAÇÃO DE MÉTODO CROMATOGRÁFICO PARA ANÁLISE DE ETANOL EM AMOSTRA DE SANGUE DE INTERESSE FORENSE
AUTORES: SANTIAGO, E.F. (UFRN) ; REGO, T.C.E.D. (UFRN) ; MOURA, M.F.V. (UFRN) ; BRITO, G.Q. (UFRN)
RESUMO: Uma metodologia analítica foi validada, utilizando cromatografia em fase gasosa - head space, para pesquisa de álcool em amostras de sangue de interesse forense. Utilizou-se detector de ionização de chama e coluna capilar de polietilenoglicol. As temperaturas do injetor, detector e coluna foram 150ºC, 250ºC e 50ºC respectivamente, com 2 mL/min de fluxo de gás na coluna e tempo de análise de 12 minutos. O método foi linear no intervalo de 0,01 a 3,2 g/L (r2 = 0,9989), sua recuperação média foi de 100,2%, os coeficientes de variação obtidos foram 5,82% a 7,28% (precisão intra-ensaio) e 5,62 a 7,28% (precisão inter-ensaio) e os limites de detecção e quantificação foram de 0,01g/L.
PALAVRAS CHAVES: cromatografia gasosa, dosagem alcoólica, validação.
INTRODUÇÃO: O método de cromatografia em fase gasosa utilizando a técnica de separação por head space é um método bastante utilizado na análise de compostos voláteis em matriz biológica (CORRÊA, 1997; LIMA, 1997; DEGANI, 1998; YONAMINE et al., 2003; WASFI, 2004; VENTORIN, 2004). A análise de álcool no sangue, realizada por este método, é o exame mais solicitado aos laboratórios de toxicologia forense (LIMA, 1997), sendo importante para estes laboratórios dispor de metodologia confiável e validada de acordo com parâmetros analíticos recomendados por organizações competentes. A validação de um método analítico inclui todos os procedimentos realizados para garantir a qualidade dos dados produzidos e deve ser realizado quando se desenvolve um método analítico ou quando se realiza adaptação em um método conhecido (BRITO, 2003; CHASIN, 1994; PORTARI 2006). Os parâmetros analíticos recomendados pela ANVISA e pelos guias internacionais para validação de métodos cromatográficos são: gráfico analítico (curva de calibração), seletividade ou especificidade, linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção e limite de quantificação (RIBANI, 2004). O emprego da cromatografia em fase gasosa com head space (CG-HS), apesar de simples, apresenta uma grande variação entre os autores e instituições que o utiliza, sendo objetivo deste estudo validar uma metodologia voltada para pesquisa de álcool no sangue na área Forense, considerando diversos parâmetros cromatográficos e embasados em diretrizes pré-estabelecidas, utilizando os critérios de validação estabelecidos por organizações competentes para a obtenção das condições necessárias à análise proposta.
MATERIAL E MÉTODOS: Amostras de sangue adicionadas de etanol e os parâmetros recomendados pela ANVISA e pelos guias internacionais para validação, foram utilizados para realização da padronização das condições cromatográficas, otimizando os parâmetros cromatográficos e avaliando a especificidade e linearidade do método; e para padronização dos procedimentos de análise, determinando a preparação da amostra, a curva de calibração, a recuperação, precisão e limite de detecção e quantificação do método. Amostras de interesse forense, coletadas de 50 vítimas de acidentes de trânsito, foram analisadas utilizando-se os procedimentos analíticos e os parâmetros cromatográficos do método proposto, demonstrando a aplicabilidade do mesmo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os parâmetros de validação estudados asseguraram a qualidade do método analítico e, conseqüentemente, a obtenção de resultados laboratoriais confiáveis. Determinando as melhores temperaturas para injetor (150ºC), detector (250ºC) e coluna (50ºC), com um fluxo de gás na coluna (2mL/min.) adequado a um tempo de análise satisfatório (12 minutos). A coluna capilar de polietilenoglicol utilizada apresentou boa resolução, separando alguns possíveis interferentes na análise de etanol no sangue. A curva de calibração foi obtida a partir da análise de amostras de sangue adicionadas de etanol em concentrações conhecidas (0,05; 0,1; 0,4; 0,8; e 3,2 g/L); na preparação desta curva foram utilizados cinco níveis de concentração conforme preconiza as diretrizes da International Conference on Harmonization (ICH) e da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), com desvio padrão relativo entre as injeções inferior a 5%, obtendo a equação de regressão linear y = 0,7542x + 0,6545 e o coeficiente de correlação r = 0,9961, demonstrando ser um método linear. A exatidão do método foi avaliada pela recuperação do etanol em amostras de sangue adicionadas nas concentrações 0,05; 0,8; e 3,2 g/L, analisadas em triplicata, conforme recomendações da ICH e da ANVISA. Os resultados obtidos, avaliados pelo teste t de Student para n - 1 graus de liberdade no nível de significância de 0,05, permitiu dizer que o método apresentou uma boa recuperação. A precisão do método foi verificada através dos coeficientes de variação (CVs) obtidos, inter e intra-ensaios, em análises de amostras de sangue (0,05; 0,8; e 3,2 g/L) realizadas em triplicata, apresentando resultado satisfatório com CV abaixo de 15%. O limite de detecção e quantificação também apresentou um CV menor que 15%, estando dentro do limite permitido. Das amostras reais de interesse forense analisadas, 66,43% apresentaram algum teor de álcool, e destes casos positivos 100% estavam dentro da faixa de linearidade do método.
CONCLUSÕES: De acordo com os resultados obtidos pode-se concluir que o método validado permitiu determinar a concentração de etanol no sangue utilizando o t-butanol como padrão interno, de forma confiável, apresentando resultados diretamente proporcionais a concentração, com precisão e exatidão adequados dentro de uma faixa de detecção apropriada ao objetivo proposto, tendo em vista que o método foi empregado em amostras reais de interesse forense, assegurando desta forma a qualidade dos resultados.
AGRADECIMENTOS: Ao CNPq pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: BRITO, N. M. et al. Validação de métodos analíticos: estratégia e discussão. Pesticidas: Revista de Ecotoxicologia e Meio Ambiente, Curitiba, V.13, p. 129-146, jan./dez. 2003.
CHASIN, A. A. M.; CHASIN, M.; SALVADORI, M. C. Validação de Métodos cromatográficos em análises toxicológicas. Revista de Farmácia Bioquímica da Universidade de São Paulo, São Paulo, v. 30, n.2, p.49-53, jul/dez, 1994.
CORRÊA, C. L. Validação da urina para análise toxicológica de etanol em “Programas de controle e prevenção do uso de álcool no local de trabalho”. 1997, 99p. Dissertação(Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 1997.
DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Cromatografia: Um breve ensaio. Química nova na escola, n. 7, p. 21-25, maio 1998.
PORTARI, G. V. Infusão de glicose e tiamina em ratos tratados com dose aguda de etanol. 2006, 101p. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Clínica Médica, Faculdade de medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2006.
RIBANI, M. et al. Validação em métodos cromatográficos e eletroforéticos. Química Nova, v. 27, n. 5, p.771-780, 2004.
VENTORIN, M. V. P. Relação entre a dosagem de etanol no sangue e na saliva. Dissertação de Mestrado, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Universidade Estadual de Campinas, Brasil, 2004.
WASFI, I. A., et al. Rapid and sensitive static headspace gas chromatography–mass spectrometry method for the analysis of ethanol and abused inhalants in blood. Journal of Chromatography B. v. 799, p. 331–336, 2004.
YONAMINE, M.; TAWIL, N.; MOREAU, R. L. M., SILVA, O. A. Solid-phase micro-extraction-gas chromatography–mass spectrometry and headspace-gas chromatography of tetrahydrocannabinol, amphetamine, methamphetamine, cocaine and ethanol in saliva samples. Journal of Chromatography B, v.789, p. 73–78, 2003.
