ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: PURIFICAÇÃO DE LIPASES EM COLUNA DE CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA COM LEITO EXPANDIDO
AUTORES: PADILHA, G.S. (UNICAMP) ; ALEGRE, R.M. (UNICAMP) ; TAMBOURGI, E.B. (UNICAMP) ; CURVELO SANTANA, J.C. (UNINOVE) ; FERREIRA, J.F. (UNICAMP)
RESUMO: Este trabalho objetivou purificar as lipase de Pseudomona cepacia, em uma coluna da adsorção em leito expandido, usando as resinas trocadoras de íons Amberlite IRA 410. A purificação das enzimas se realizou em três condições de leito expandido (H): uma vez e meia (6 cm), duas (8 cm) e três (12 cm) vezes a altura inicial do leito fixo (H0 = 4 cm). Na purificação das enzimas, observou-se que na melhor condição um fator de purificação próximo de 80 foi encontrado para uma altura de leito expandido igual a 6 cm, o que corresponde a um grau de expansão igual a um e meio.
PALAVRAS CHAVES: lipase, purificação, coluna cromatográfica
INTRODUÇÃO: Dentre os diversos produtos biotecnológicos, as lipases (triglicerol acil-hidrolases E.C. 3.1.1.3) são enzimas lipolíticas que hidrolisam ligações ésteres de triacilgliceróis e serão estudadas neste trabalho. Um importante aspecto das enzimas lipoliticas é sua característica de catalisar reações na interface óleo-água. Muitas das lipases são solúveis em água e agem em substratos insolúveis em água, este fato diferencia as lipases das esterases, já que essas agem em substratos solúveis em água. As lipases são encontradas em diversos organismos, incluindo animais, plantas, fungos e bactérias. O rápido crescimento celular, em relação aos fungos, é uma das vantagens das fontes bacterianas como produtoras destas enzimas, além de serem consideradas de alto potencial biotecnológico devido à estabilidade em elevadas temperaturas e a solventes orgânicos. Dependendo da fonte, as lipases podem ter massa molecular variando entre 20 a 75 kDa, atividade ótima em pH na faixa entre 6 a 8 e em temperaturas entre 30 e 40 °C (Beisson et al., 2000; Borgström and Brockman, 1984; Kordel et al., 1991; Pastore et al., 2004).
Pastore et al. (2003) obtiveram lipases de Rizopus sp. após fermentação em meio contendo azeite de oliva. Depois, estas enzimas foram purificadas usando fracionamento com sulfato de amônio e cromatografia em resina SEPHADEX, o fator de purificação ficou próximo de 5 e a recuperação da atividade ficou abaixo dos 3%. Sharma et al. (2002) purificou e caracterizou uma lipase de Bacilus sp. RSJ.1. A purificação se deu em etapas,onde após a última etapa se alcançou um fator de purificação acima dos 200, embora a recuperação da atividade da enzima tenha sido de inferior aos 20%. Outras técnicas empregadas à purificação de lípases são citadas por Saxena et al (2003). Assim, neste trabalho foi realizada a purificação de lipases de Pseudomona cepacia, por processos cromatográficos de troca iônica, usando a técnica da adsorção em leito expandido.
MATERIAL E MÉTODOS: Material
Microorganismos: cepas de Pseudomona cepacia, obtidas da Fundação André Tosello, e mantido a 4°C em agar-nutriente.
Coluna de adsorção em leito expandido: coluna de vidro, com 1 cm de diâmetro interno e 30 cm de altura, possuindo um pistão que, por ser ajustável, reduz o espaço morto acima do leito quando o mesmo se encontrar expandido. Este pistão tem sua haste perfurada desde a base até seu topo, de forma a permitir a passagem de fluido vindo da coluna. Uma malha de 60 mesh foi posicionada na base da coluna e na base do pistão, para manter as resinas dentro da coluna, evitando as perdas da resina, por sedimentação e por arraste.
Partículas: resinas de troca iônica Amberlite IRA 410, de diâmetro médio 4,4.10-4 m, massa específica 1,12 g/cm3 (VETEC, Rio de Janeiro).
Métodos
Purificação das lipases: o leito cromatográfico foi composto por 2 g da resina de troca iônica Amberlite IRA 410. A adsorções das enzimas foram realizadas com o sistema em expandido em uma vez e meia (6 cm), duas (8 cm) e três vezes (12 cm) a altura do leito fixo (4 cm), a temperatura ambiente (22 °C) e pH 7. O leito de adsorventes foi pré-equilibrado na altura de trabalho com uma solução tampão fosfato (0,07 M), então, 5 mL da meio fermentado contendo as lipases foram injetados no fluxo. A eluição foi feita pelo uso de uma solução de NaCl 0,25 M a 14 mL/min de fluxo descendente. Para tal, o pistão foi baixado até 2 cm acima da altura do leito fixo, para só então ser iniciada a eluição, na qual amostras contendo 5 mL cada, foram coletadas.
Determinação das atividades das lipases: preparou-se o substrato conforme metodologia de Soares (2000). A proteína total foi medida pelo método de Bradford (1976).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A seguir, nas Figuras 1 e 2 estão apresentadas as curvas de cromatografia característica do meio fermentado passando e adsorvendo no leito de resinas de troca iônica expandidas a uma vez e meia, duas e três vezes a altura do leito fixo, para as proteínas e atividade de lípases, respectivamente. Detecta-se a adsorção, passagem e eluição das biomoléculas pela análise das curvas de proteínas, bem como, nota-se a presença das lipases por sua curva de atividade enzimática. Distinguem-se as etapas de adsorção das demais por ser a região onde nota-se pouco ou nenhuma passagem de proteínas, iniciando uma etapa de lavagem do leito, onde todas as biomoléculas não adsorvidas são retiradas do meio adsortivo, até que o conteúdo protéico chegue a um valor mínimo e, a na eluição se nota a dessorção das enzimas e proteínas adsorvidas na resina (Curvelo Santana, 2006; Kalil, 2000; Santos, 2001).
Na condição de grau de expansão igual a uma e meia (1,5) vezes a altura do leito fixo o fator de purificação ficou próximo dos 80, isso aconteceu provavelmente, porque a velocidade do fluido nesta condição foi ideal para promover a exposição completa de toda a área superficial da resina adsorvente, aumentando a interação partícula-biomolécula e, com ela, elevando a adsorção das enzimas (Amersham Pharmacia Biotech, 1997; Biazus et al., 2006; Curvelo Santana, 2006; Fernandez–Lahore et al., 2001; Kalil, 2000; Santos, 2001; Sosa et al., 2001). O fator de purificação e a recuperação da atividade foram maiores que os obtidos por Pastore et al. (2003) e Saxena et al. (2003), entretanto, foi menor que o obtido por Sharma et el. (2002).
CONCLUSÕES: Observou-se que a resina de troca iônica Amberlite IRA 410 e o tampão fosfato foram, bons meios de adsorção e de transporte, de forma que ambos promoveram uma boa afinidade entre a resina e as lipases. A recuperação da atividade e o fator de purificação da enzima aumentaram com a redução do grau de expansão do leito, sendo mais alta para uma expansão igual a 1,5 vezes (6 cm) a altura do leito fixo (4 cm), condição essa que promoveu a total recuperação da enzima (acima de 100%)e um fator de purificação próximo a 80.
AGRADECIMENTOS: Os autores agradecem ao CNPq e a CAPES pelo suporte financeiro.
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