ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: DESENVOLVIMENTO DE ELETRODOS BIOCOMPÓSITOS PARA DETERMINAÇÃO DA TROPONINA T CARDÍACA HUMANA
AUTORES: HOLANDA, M. A. (UPE) ; CAVALCANTI, I. T. (RENORBIO) ; MENDONÇA, B. V. (UPE) ; FREITAS, T. A. (UPE) ; MOURA, P. M. M. (UPE) ; DUTRA, R. F. (UPE)
RESUMO: Eletrodos utilizando biocompósitos têm sido explorados no desenvolvimento de biossensores com diferentes aplicações. Neste trabalho, um eletrodo compósito de prata-epóxi modificado com tetracianoquinodimetano (TCNQ) foi empregado como imunossensor para determinação da troponina T cardíaca humana (TnT), um marcador específico e considerado padrão ouro para o diagnóstico do infarto agudo do miocárdio (IAM). Nanopartículas revestidas com estreptavidina foram co-imobilizadas à superfície eletródica para promover maior quantidade de material imobilizado. Foi mostrado alto coeficiente de correlação (R=0,996; p<0,001), combinado a um baixo erro relativo (3,5%) com faixa linear de resposta até 100ng/mL.
PALAVRAS CHAVES: imunossensor, eletrodo biocompósito, troponina t
INTRODUÇÃO: A identificação dos níveis de troponina tem a vantagem de possibilitar a detecção precoce do IAM, visto que estes aumentam concomitante à extensão da necrose das células cardíacas (STIELGER et al., 2000). As troponinas são atualmente consideradas marcadores altamente específicos na injúria miocárdica, quando comparadas às creatinoquinase e a desidrogenase láctica (CAMERON et al., 2007). No entanto, as determinações das troponinas nem sempre estão disponíveis nos sistemas de saúde por apresentarem custos mais elevados. Neste sentido, o desenvolvimento de sistemas imunoensaios mais práticos e baratos, que possam ser empregados em emergências cardiológicas, apresenta-se como alternativa. Os eletrodos biocompósitos apresentam uma estável imobilização, devido a fácil incorporação de biomoléculas e mediadores, além de serem excelentes transdutores (CORB et al., 2007; PIVIDORI et al., 2007). A incorporação de nanopartículas, bem como nanotubos, aos eletrodos de carbono vem permitindo a obtenção de eletrodos mais sensíveis e estáveis. Neste trabalho foi desenvolvido um imunossensor, empregando eletrodo compósito de prata-epóxi modificado com TCNQ para determinação da TnT, a partir da reação catalítica com o peróxido de hidrogênio. Anticorpos anti-TnT biotinilados foram imobilizados em nanopartículas de estreptavidina co-imobilizada ao biocompósito.
MATERIAL E MÉTODOS: Os eletrodos compósitos foram do obtidos do homogenato que consistiu de 48% (p/p) de resina epóxi-prata, 32% (p/p) de aglutinante epóxi-prata aglutinante, 10% (p/p) de pó de grafite e 10% (p/p) de TCNQ, curado a 65ºC por 12horas. O homogenato foi empacotado em um suporte plástico com área de superfície de cerca de 1,5mm2. O contato elétrico do homogenato com o sistema potenciostato foi obtido por um pino de ouro. As nanopartículas complexadas com estreptavidina e anticorpo anti-TnT biotinilado foram co-imobilizadas à superfície via glutaraldeído (2,5%). Uma solução de glicina (100mM) foi utilizada para bloquear as reações não-específicas e a determinação da TnT foi realizada através da incubação anti-TnT conjugado à peroxidase (anti-TnT-HRP). Os ensaios eletroquímicos foram realizados usando um sistema tri-eletródico, que consistiu em um eletrodo de trabalho (eletrodo compósito, área de superfície 0,1mm2), um eletrodo auxiliar de platina e um eletrodo de Ag/AgCl como de referência. As análises por voltametria cíclica foram realizadas em tampão PBS 0,1M (pH 7,4), usando um potenciostato, modelo MPQG-01, acoplado a um microcomputador, cujas leituras foram estabelecidas a uma velocidade de varredura de 100 mV s-1 e um intervalo de potencial de -1,6 a +1,6 V.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os eletrodos de epóxi-prata modificados com TCNQ apresentaram respostas eletroquímicas significativas na faixa de varredura de potencial de -1,6V a +1,6V. Picos anódicos e catódicos foram observados nos voltamogramas cíclicos, possivelmente atribuídos a um mecanismo de transferência de cargas envolvendo o par redox TCNQ0/TCNQ- e a enzima peroxidase (HRP) conjugada ao anti-TnT. Pode-se notar um aumento na amplitude dos picos quando o mediador foi incorporado na pasta, comprovando a eficiência do TCNQ em promover uma melhor condução da corrente elétrica (Figura 1). Os potenciais dos picos de oxidação e redução situaram-se em 0,54V e -0,45V, respectivamente, aproximando-se de uma característica típica de redução do TCNQ0/TCNQ- e o seu provável acoplamento redox TCNQ-/TCNQ0 – HRP/HRPox na superfície do eletrodo (LLOPIS et al., 2005). Os registros mostraram aumento linear da resposta amperométrica quando diferentes concentrações de TnT, preparadas em tampão PBS 0,1M, foram testadas. As respostas de corrente foram obtidas a um potencial de +0,54V (vs Ag/AgCl), quando a amostra, seguida por incubação com anti-TnT-HRP, sofreu injeção de 50mmol.L-1 peróxido de hidrogênio. A curva de calibração apresentou um alto coeficiente de correlação (R=0,996; p<0,001), combinado a um baixo erro relativo (3,5%) com faixa linear de resposta até 100ng/mL (Figura 2). Esses resultados comprovam a funcionalidade do eletrodo compósito, o qual apresentou uma boa precisão e sensibilidade na determinação eletroquímica da troponina T cardíaca humana.
CONCLUSÕES: O eletrodo biocompósito proposto mostrou resultados satisfatórios na determinação da troponina T cardíaca humana, com níveis de determinação de interesse clínico para diagnóstico do infarto agudo do miocárdio.
AGRADECIMENTOS: CNPq e UPE
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: CAMERON, S. J.; SOKOLL, L. J.; LATERZA, O. F.; SHAH, S.; GREEN, G. B. 2007. A multi-marker approach for the prediction of adverse events in patients with acute coronary syndromes. Clinica Chimica Acta, 376: 168-173.
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LLOPIS, X.; MERKOÇI, A.; DEL VALLE, M.; ALEGRET, S. 2005. Integration of a glucose biosensor based on an epoxy-graphite-TTF•TCNQ-GOD biocomposite into a FIA system. Sensors and Actuators B: Chemical, 107: 742-748.
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STIEGLER, H.; FISCHER, Y.; VAZQUEZ-JIMENEZ, J. F.; GRAF, J.; FILZMAIER, K.; FAUSTEN, B.; JANSSENS, U.; GRESSNER, A. M.; KUNZ, D. 2000. Cardiac Troponin T and I Results in Heparin-Plasma Than in Serum. Clinical Chemistry, 46: 1338-1344.
