ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: EMPREGO DE FIBRAS DE CARBONO NO DESENVOLVIMENTO DE SENSORES ELETROQUÍMICOS APLICADOS EM IMUNOENSAIOS
AUTORES: FREITAS, T.A. (UPE) ; MATTOS, A.B. (RENORBIO) ; MERCÊS, A.M.A. (RENORBIO) ; SILVA, V.L. (UFPE) ; DUTRA, R.F. (UPE)
RESUMO: Um dos atuais e grandes desafios na área de biossensores, sobretudo aqueles voltados para imunoanálises, tem sido a garantia de reprodutibilidade e sensibilidade diagnósticas adequadas à confiabilidade comercialmente exigida. Dentre os materiais utilizados em imunossensores estão as fibras de carbono (FC), devido às suas inúmeras vantagens, destacando-se: baixa densidade associada à alta resistência mecânica, boa condutividade e baixo custo. Neste trabalho a FC foi usada para construção de um eletrodo de baixo custo, a partir da imobilização de anticorpos monoclonais (anti-IgG). Após realizados estudos cinéticos e voltamétricos, a curva de calibração alcançou alta linearidade (R=0,986) e boa reprodutibilidade com erro relativo menor que 3,5%.
PALAVRAS CHAVES: imunoglobulina; fibra de carbono; imunossensor eletroquímico
INTRODUÇÃO: O interesse por técnicas rápidas, sensíveis e de baixo custo para diagnóstico tem aumentado devido ao crescente desenvolvimento alcançado pelos sistemas de imunoensaios. Neste sentido, a fusão dos métodos clássicos com outras metodologias analíticas constitui-se numa saída para superar estas desvantagens e expressa-se no desenvolvimento e aperfeiçoamento de imunossensores (ROSATTO et al., 2001). Estes dispositivos bio-eletrônicos são compostos por anticorpo/antígeno imobilizado sobre uma superfície sensora acoplada a um transdutor (YUAN, CHAI & TANG, 2007). O desenvolvimento de técnicas de imobilização tem sido importante por proporcionar resultados confiáveis, possível reutilização da superfície sensora de modo a reduzir os custos e aumentar a estabilidade. Esses fatores dependem principalmente da escolha apropriada do suporte e dos reagentes utilizados no processo (FATIBELLO-FILHO & VIEIRA, 2002; KRAJEWSKA, 2004). Entre os materiais utilizados na imobilização das biomoléculas e de desenvolvimento de imunossensores, estão os materiais de carbono, em especial as fibras de carbono (FC), devido às suas inúmeras vantagens, destacando-se: baixa densidade associada à alta resistência mecânica, boa condutividade, regularidade na conformação o que garantem propriedades específicas e controladas (AGÜÍ, YAÑNEZ-SEDEÑO & PINGARRÓN, 2006). Por estas características, as FCs apresentam-se como potencial na construção de eletrodos para imunoanálises com pequenas dimensões e diferentes formatos, que venham apresentar maior reprodutibilidade associada a um baixo custo. O objetivo do trabalho foi construir e caracterizar eletrodos de FC para imobilização de anti-IgG utilizando transdução eletroquímica.
MATERIAL E MÉTODOS: O transdutor eletroquímico foi constituído com três eletrodos acoplados a um potenciostato (MQPG-01). Um eletrodo de FC, como de trabalho; um eletrodo de fio de platina, como auxiliar e um eletrodo de Ag/AgCl, como referência. A etapa inicial de preparação dos eletrodos de FC consistiu no processo de limpeza da superfície das fibras, onde foram realizadas sucessivas lavagens com água destilada, seguidas por banho ultra-sônico por 5 minutos. Anticorpos monoclonais anti-IgG produzidos em cabra foram imobilizados nos eletrodos. Três métodos de imobilização foram testados. No método via EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida), os eletrodos limpos de FC foram incubados com solução de EDC (0,2M) em tampão acetato de sódio 0,2M, pH 4,8 por 2 horas. No método via EDC+Glutaraldeído (Glut), os eletrodos foram incubados com uma solução de EDC (0,2M) em tampão acetato de sódio 0,1M, pH 4,8 por 2 horas. Logo após, foram imersos em solução de Glut numa concentração de 0,625% (v/v) por 45 minutos. No método via EDC/NHS (N-hidroxi-succinamida), os eletrodos de FC foram incubados em uma mistura de EDC (0,2M) /NHS (0,1M) (1:1) preparada em tampão acetato de sódio 0,2M, pH 4,8 por 2 horas. Aos eletrodos de FC modificados foi adicionada uma solução de anti-IgG (1µg/mL) por 1 hora. A avaliação dos métodos foi realizada mediante imunoensaio enzimático (ELISA), após a incubação com anti-IgG conjugado à peroxidase. Efeitos da concentração de anti-IgG (0,2; 1,0; 10,0 e 100,0 µg/mL) e estudos cinéticos quanto ao pH (5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0) e temperatura de incubação (4,0; 16,0; 27,0; 37,0 oC) foram realizados. Para a caracterização dos eletrodos de FC foi realizada a técnica eletroquímica de voltametria cíclica (velocidade de varredura 100mVs-1).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os resultados de imobilização na superfície das fibras de carbono mostraram que comparando os métodos de imobilização, o via EDC+GLUT apresentou maior desempenho com relação aos demais (Fig. 1), indicando maior quantidade de anti-IgG imobilizado e maior imunorreatividade observada pelas absorbâncias medidas, mostrando baixo impedimento estérico da biomolécula (HUANG et al., 2005). A imobilização via EDC+GLUT foi então selecionada e estudos de determinação de zona de equivalência mostraram que a concentração de 10 µg/mL de anti-IgG imobilizados foi ideal como resposta à quantidade de antígenos ofertados. O pH 6.5, foi considerado ótimo para uma melhor orientação do anti-IgG imobilizado. Na temperatura de 37oC foi alcançado um aumento aproximado de 10% na imunorreatividade quando plotadas as curvas termodinâmicas. Após realizados estudos cinéticos e voltamétricos, a curva de calibração alcançou alta linearidade (R=0,986) (Fig. 2) e boa reprodutibilidade com erro relativo menor que 3,5%, mostrando a viabilidade da FC como proposta de baixo custo na construção de eletrodos descartáveis.
CONCLUSÕES: Diante dos resultados apresentados, as FC apresentaram-se potencialmente adequadas para a construção de eletrodos de baixo custo voltados para imunodiagnóstico, em substituição aos de custos mais elevados, como ouro e platina. Além disso, o design proposto na confecção do eletrodo de FC desenvolvido apresenta-se viável para a produção em massa de imunossensores mais reprodutíveis e sensíveis, comparados aos existentes.
AGRADECIMENTOS: FACEPE, FINEP e UPE.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: AGÜÍ, L.; YAÑNEZ-SEDEÑO, P.; PINGARRÓN, J. M. 2006. Preparation and characterization of a new design of carbon-felt electrode for phenolic endocrine disruptors. Electrochimica Acta, 51: 2565–2571.
FATIBELLO-FILHO, O.; VIEIRA, I. C. 2002. Uso analítico de tecidos e de extratos brutos vegetais como fonte enzimática. Química Nova, 25:455-464.
HUANG, L.; REEKMANS, G.; SAERENS, D.; FRIEDT, J.M.; FREDERIX, F.; FRANCIS, L.; MUYLDERMANS, S.; CAMPITELLI, A; HOOF, C.V. 2005. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosensor and Bioeletronics, 21:483-490.
KRAJEWSKA, B. 2004. Application of chitin and chitosan based materials for enzyme immobilizations: a review. Enzyme and Microbial Technology, 35:126-139.
ROSATTO, S. S.; FREIRE, R. S.; DURÁN, N.; KUBOTA, L. T. 2001. Biossensores amperométricos para determinação de compostos fenólicos em amostras de interesse ambiental. Química Nova, 24: 77-86.
YUAN, O. C.; CHAI, R.; TANG, Y. 2007. A novel amperometric immunosensor based on layer-by-layer assembly of gold nanoparticles-multi-walled carbon nanotubes-thionine multilayer films on polyelectrolyte surface. Analytica Chimica Acta, 603:205-213.
