ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: Isolamento de leveduras selvagens assimiladoras de metanol em Fortaleza-Ceará.
AUTORES: MALLMANN, E.J.J. (UECE.UFC) ; REBOUÇAS, F.D.J. (UVA) ; AMORIM, L.A (UFC) ; NASCIEMNTO, K.M (UECE) ; CUNHA, F.A (UFC) ; SOUSA, G.C. (UFC.CENTEC) ; SANTOS, R.S. (UFC) ; SOARES, K.P (UECE) ; LIMA NETO, J.G. (UFC.UECE) ; MENDES, L.G (UECE.UFC) ; MENEZES, E.A (UFC)
RESUMO: Leveduras são organismos eucariotos e necessitam de uma fonte externa de carbono para gerar energia para célula. Leveduras que assimilam metanol têm despertado interesse nos últimos anos devido a sua utilidade em biotecnologia. O objetivo desse estudo foi avaliar a capacidade de leveduras selvagens isoladas em Fortaleza no Ceará em utilizar o metanol como única fonte de carbono e energia. Foram avaliadas 29 cepas de leveduras selvagens. Foram identificadas em nosso estudo, 3 (10,34%) leveduras metilotróficas.
PALAVRAS CHAVES: leveduras. metanol. biotecnologia.
INTRODUÇÃO: Leveduras são organismos eucariotos. O carbono pode ser fornecido às leveduras na forma de açúcar, aldeídos, sais de alguns ácidos orgânicos, glicerina ou etanol, ou de alguma outra forma, dependendo do tipo da levedura. Ao considerar os açúcares como fonte de carbono, é importante lembrar a diferença que existe entre a capacidade de uma levedura em assimilar um açúcar e sua capacidade de fermentar o mesmo açúcar (6). A habilidade de utilizar metanol como fonte de carbono e energia é limitada em eucariotos a poucas espécies de leveduras (10). As vias bioquímicas são muito parecidas nas diversas espécies e começam com a oxidação do metanol a formaldeído, catalisado pela enzima álcool oxidase uma enzima localizada na matriz peroxissomal. Um subproduto dessa reação é o peróxido de hidrogênio, que é degradado por uma segunda enzima da matriz, a catalase. O formaldeído formado segue uma das duas vias disponíveis. Uma parte deixa o peroxissomo e é oxidado por duas enzimas citoplasmáticas a formaldeído desidrogenase e formato desidrogenase, para gerar energia para célula. O restante do formaldeído é condensado com a xilulose-5-fosfato por uma terceira enzima peroxissomal a diidroxicetona sintase, para gerar duas moléculas de três carbonos que deixam o peroxissomo e entram no ciclo que regenera a xilulose-5-fosfato e produz uma molécula de gliceraldeído-3-fosfato para cada três rodadas desse ciclo (2,10). Leveduras metilotróficas têm despertado interesse nos últimos anos devido a sua utilidade em biotecnologia. Muitas dessas leveduras são Ascomicetos dos gêneros Hansenula, Pichia e Candida (2,4). O objetivo desse estudo foi avaliar a capacidade de leveduras selvagens isoladas em Fortaleza no Ceará em utilizar o metanol como única fonte de carbono e energia.
MATERIAL E MÉTODOS: Foram estudadas hortaliças, flores, folhas e frutos no Campus do Pici da UFC. As amostras foram colocadas em sacos plásticos e transportadas para o laboratório de Microbiologia do Departamento de Análises Clínicas da Universidade Federal do Ceará. As amostras foram trituradas em liquidificador com água peptonada 0,1%, depois foram inoculadas em ágar extrato de malte com cloranfenicol e incubadas a 28°C, 3-5 dias. Após o crescimento as leveduras foram isoladas e purificadas com os seguintes testes: técnica lâmina-lamínula azul de algodão, coloração de Gram. As leveduras purificadas foram avaliadas quanto à assimilação de metanol. Foram avaliadas 29 cepas de leveduras selvagens. A assimilação de metanol foi realizada em meio de cultura contendo: metanol 1%, sulfato de amônio 4 g/L, sulfato de magnésio heptaidratado 1 g/L, fosfato monopotássico 1g/L, cloreto de cálcio 0,1g/L e ágar 20 g/L. A levedura que se mostrava positiva nesse meio era cultivada no mesmo meio sem a presença do ágar, durante 3-5 dias a 28°C. A assimilação foi confirmada com a verificação do crescimento da levedura, observado em microscópio ótico (1,6).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A identificação de leveduras que assimilam metanol tem aumentado rapidamente (8). Foram identificadas em nosso estudo, 3 (10,34%) leveduras metilotróficas, dentre as 29 leveduras estudadas. O formaldeído é um intermediário central do metabolismo metilotrófico, sendo um ponto de ligação entre as vias de assimilação e dessamilação do metanol (7). O formaldeído é muito tóxico para células devido a sua reação com o DNA e proteínas (7,8), os níveis de formaldeído devem ser mantidos sobre rigoroso controle. Leveduras metilotróficas são relativamente mais resistentes ao formaldeído do que leveduras convencionais, elas são capazes de crescer em meios contendo 16 mM de formaldeído ou mais (2). Formaldeído é considerado um dos mais importantes compostos químicos comerciais em aplicação na síntese química de resinas. È utilizado para produzir detergentes, sabões (5). Durante o processo de ozonização da água, o formaldeído pode ser formado durante a reação do ozônio com a matéria orgânica (9). Formaldeído é classificado como mutagênico e possível carcinógeno humano (3), torna-se necessário o controle dos níveis de formaldeído em diversos produtos e ambientes, para isso torna-se necessário desenvolver um método analítico que seja simples, barato, sensível e seletivo para análise desse composto. Se dessas leveduras forem isoladas e purificadas a enzima formaldeído desidrogenase ela pode ter um emprego químico analítico importante(1). Em estudos realizados com enzimas purificadas de leveduras que assimilam metanol, os pesquisadores concluíram que o método analítico atende aos requisitos necessários para os testes de detecção do formaldeído em diversas amostras.
CONCLUSÕES: O isolamento dessas leveduras que assimilam metanol é um dos primeiros passos na direção da utilização dessas leveduras com finalidades analíticas e industriais. Como agentes de despoluição e agentes de mensuração dos níveis de formaldeído em amostras, principalmente biológicas. A busca por novas leveduras que assimilam metanol e formaldeído continua, no sentido de se encontrar novas cepas com utilidade biotecnológica.
AGRADECIMENTOS: A Universidade Federal do Ceará por permitir a realização dessa pesquisa.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: 1. DEMKIV, O.M, et al. Formaldehyde dehydrogenase from the recombinant yeast Hansenula polymorpha : isolation and bioanalytic application. FEMS Yeast Res 5:1–7.2007.
2. FABER, K. N., P. HAIMA, C. GIETL, W. HARDER, G. AB, AND M. VEENHUIS. Methylotrophic yeasts as factories for the production of foreign proteins. Yeast 11:1331-1344. 1995.
3. FERON, V.J.; TIL, H.P.; DE VRIJER, F.; WOUTERSEN R.A.; CASSEE F.R.; VAN BLADEREN P.J. Aldehydes: occurrence, carcinogenic potential, mechanism of action and risk assessment. Mutat Res, 259: 363–385.1991.
4. GATZKE, R., U. WEYDEMANN, Z. A. JANOWICZ, AND C. P. HOLLENBERG. Stable multicopy integration of vector sequences in Hansenula polymorpha. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43:844-849. 1995.
5. GERBERICH, H.R.; SEAMAN G.C. Encyclopedia of Chemical Technology, V. 11. 4th ed. pp. 929–951. John Wiley & Sons, New York. 1994.
6. MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; PARKER, J. Biology of microorganisms. 8 ed. New Jersey: Prentice Hall, 1997.
7. MURDANOTO, A.P. et al. Purification and Properties of Methyl Formate Synthase, a Mitochondrial Alcohol Dehydrogenase, Participating in Formaldehyde Oxidation in Methylotrophic Yeasts. Applied Env. Microbiol, (5):1715–1720. 1997.
8. PÉTER, G.; TORNAI-LEHOCZKI, J.; FULOP, l.; DLAUCHY, D. Six new methanol assimilating yeast species from wood material. Antonie von Leewenhoek, 84:147-159.2003.
9. SCHECHTER D.S.; SINGER P.C.Formation of aldehydes during ozonation. Ozone Sci Eng, 17: 53–55.1995.
10. VEENHUIS, M., VAN DIJKEN, J. P., HARDER, W. The significance of peroxisomes in the metabolism of one-carbon compounds in yeast. Adv. Microbiol. Physiol. 24:1-82. 1983.
