ÁREA: Iniciação Científica
TÍTULO: Estudo inicial da Beta-galactosidase da parede celular da polpa de sapoti (Manilkara sapota L. Von Royen) maduro.
AUTORES: BARBOSA, G.K.C (UFC) ; MIRANDA, M.R.A (UFC) ; MENDES,L.G (UFC,UECE)
RESUMO: Existe uma correlação entre o amaciamento de sapoti e a atuação da Beta-galactosidase na parede celular, deu-se início ao estudo do efeito do pH e da temperatura desta enzima extraída da parede celular de sapoti. Para essa extração, utilizou-se 200 g de polpa, homogeneizada com o tampão Fosfato pH 5,5 com mercaptoetanol 1mM.Lavou-se com 6 L de água destilada utilizando filtração a vacuo. O material retido no filtro foi ressuspenso em mesmo tampão com NaCl 3 M e deixado por 24 hs a 4°C, sob constante agitação.Em seguida, foi centrifugado a 9000 x g por 30 min a 4°C.O sobrenadante dialisado contra o mesmo tampão por 12 hs,para a obtenção do extrato bruto. A atividade Beta-galactosidásica do extrato bruto de parede celular de sapoti apresentou um pH ótimo de 4,0 e uma temperatura ótima 60°C.
PALAVRAS CHAVES: sapoti, beta-galactosidase, parede celular.
INTRODUÇÃO: O sapotizeiro (Manilkara zapota L. Von Royen) é nativo da América Central, mais especificamente do sul do México. No Brasil, esta espécie adaptou-se em praticamente todo o país. Contudo, sua melhor adaptação foi na região Nordeste, a qual apresenta altas temperaturas e umidade que favorecem o seu crescimento e produção (1). O desenvolvimento de tecnologias para melhorar a qualidade e o potencial de conservação de um fruto depende do conhecimento dos processos fisiológicos que regulam o amadurecimento e senescência. A mais característica alteração que ocorre durante o amadurecimento do sapoti é o amaciamento que resulta em uma menor firmeza da polpa, sendo esse o principal indício de que o fruto está apto para o consumo. Estudos mostraram que o decréscimo na firmeza que ocorre à medida que o sapoti amadurece é resultado principalmente da hidrólise enzimática da parede celular (3).
A Beta-galactosidase é uma enzima hidrolítica que age em conjunto com as enzimas pectolíticas (PG e PME) pra afrouxar a estrutura da parede celular (2). Sua ação consiste na quebra de ligações cruzadas do tipo 1,4 Beta-galactosídicas entre os polímeros pécticos e de hemicelulose e precede a ação da PME. Isso foi comprovado pela perda de resíduos de galactose da parede celular antes do acúmulo de poliuronídeos solúveis e pelo fato de que esses poliuronídeos não possuíam resíduos galactosil em estrutura, diferentemente de quando se encontravam na parede (8). O objetivo desse trabalho foi estabelecer a metodologia inicial para purificação da Beta-galactosidase de parede celular da polpa de sapoti maduro.
MATERIAL E MÉTODOS:
Os sapotis (M. sapota) ‘Sapota Tropical’ foram colhidos “de vez” na Estação Experimental do Vale do Curu da Embrapa Agroindústria Tropical e armazenados em ambiente até atingirem o estádio maduro, quando as polpas foram homogeneizadas e congeladas. A extração da Beta-galactosidase da parede celular foi realizada segundo metodologia de RANWALA et al (1992) com modificações , quando 200 g de polpa foram homogeneizados em 400 mL de tampão fosfato pH 5,5 com mercaptoetanol 1mM e depois lavados com 6 L de água destilada, sob filtração a vácuo. O material retido no filtro foi ressuspendido em 200 mL do mesmo tampão com NaCl 3 M e deixado por 24 h a 4°C, sob agitação e em seguida, foi centrifugado a 9.000 x g por 30 min a 4°C. O sobrenadante foi dialisado contra o mesmo tampão por 12 h com 2 trocas, obtendo o extrato bruto da parede celular.
No extrato bruto, a atividade Beta-galactosidásica foi avaliada entre as faixas de pH de 2,5 a 6,0. Quanto a temperatura ótima, as enzimas do extrato bruto foram pré-incubadas entre 30 e 80ºC por 10 minutos e depois sua atividade foi monitorada.
A atividade da Beta-galactosidase da parede celular da polpa do sapoti maduro foi determina com o método descrito por KANFER et al (1973) (4). A atividade Beta-galactosidásica total foi expressa em UA x h-1, levando em consideração a densidade ótica, a diluição feita no material e o volume total do material em uso. A concentração protéica da parede celular foi determinada de acordo com metodologia de BRADFORD (9).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A metodologia inicial para a purificação da Beta-galactosidase de parede celular de sapoti maduro está descrita no item anterior MATERIAL E METÓDOS. O estudo da atividade Beta-galactosidásica do extrato bruto em função do pH do meio de reação é apresentado na Figura 1-Atividade Beta-galactosidásica do extrato bruto da polpa de sapoti ‘Sapota tropical’ maduro em função do pH. A atividade do extrato bruto aumentou até pH 4,0 quando se observou a melhor resposta e a partir de então, a atividade Beta-galactosidásica decresceu.
O efeito de diferentes temperaturas na atividade Beta-galactosidásica do extrato bruto pode ser observada na Figura 2-Atividade Beta-galactosidásica do extrato bruto da polpa de sapoti ‘Sapota tropical’ maduro em função da temperatura. A enzima mostrou um aumento de atividade quando incubada nas temperaturas de 30ºC a 60ºC, quando então apresentou a maior atividade. Em temperaturas acima de 60ºC, atividade decresceu atingindo inatividade aos 80ºC. Os valores de atividade relacionados às diferentes temperaturas de sapoti assemelham-se aos encontrados por BARBOSA(2000). No entanto, KUNDU et al(1990) estudando Beta-galactosidase em cenoura verificaram que atividade enzimática permaneceu estável quando enzima foi pré-incubada por 20 min em temperaturas de até 50ºC e que, entretanto a enzima perdeu 50 a 100% de atividade nas temperaturas de 55 a 65ºC.
CONCLUSÕES: O extrato bruto da parede celular de sapoti ‘Sapota tropical’ maduro foi obtido para posterior purificação da enzima Beta-Galactosidase. Essa fração apresentou máxima atividade Beta-galactosidásica em pH 4,0 e na temperatura de 60ºC. Os resultados obtidos permitem a continuidade no estudo de purificação e caracterização da Beta-Galactosidase da parede celular de sapoti cv ´Sapota tropical` para assim, entender melhor seu papel no processo de amaciamento durante o amadurecimento dos frutos.
AGRADECIMENTOS: Embrapa Agroindústria Tropical pelos frutos utilizados nesse trabalho.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: 1. BANDEIRA, C.T. et al. O cultivo do sapotizeiro. Fortaleza: Embrapa-CNPAT, 2003. 20p.(Circular Técnica, 13).
2. KONNO, H.; YAMASAKI, Y.; KATOY, K. Characteristics of Beta-galactosidase purified from cell suspension cultures of carrot. Physiol. Plant., v. 68, p. 46-52, 1986.
3. MIRANDA, M.R.A. Alterações fisiológicas e histológicas durante o desenvolvimento, maturação e armazenamento refrigerado do sapoti. 2002. 136p. Tese de Doutorado em Fitotecnia-Universidade Federal do Ceará.
4. KANFER, J.N., PETROVICH, G. & MUMFORD, RE.A. Purification of e Beta-galactosidases by affinity chromatography. Anal. Biochem. v.5, p. 301-305, 1973.
5.RANWALA, A.P.; SUEMATSU, C.; MASUDA, H. The role of Beta-galactosidades in the modification of cell wall components during muskmelon fruit ripening. Plant Physiology, Rockville, v.100, n. 3,p. 1318-1325, 1992.
6. BARBOSA, G.K.C. Propriedades das Beta-galactosidases cotiledonáceas das cultivares ‘Vita 3’ e ‘Vita 5’ de feijão-de-corda. Fortaleza, 2000, Monografia de graduação. 38p.
7. KUNDU, R.H.; DE KUNDU, P.; BANERJEE, A.C. Multiple forms of Beta-galactosidase from the germination of seeds of Vigna radiata. Phytochemistry, v. 29, p. 2079-2082, 1990.
8. BARTLEY, I.M. Beta-galactosidase in ripening aples. Phytochemistry, v. 13, p.2107-2111, 1974.
9. BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method four the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of the dye binding. Anal. Biochem. v.72, p. 248-254, 1976.
