ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: AVALIAÇÃO DA ACETILCOLINESTERASE DE PEIXE DA LAGOA MUNDAÚ PARA USO COMO BIOMARCADOR DE PESTICIDAS
AUTORES: ALVES, R. M (UFAL) ; COSTA, A. L. S (UFAL) ; VIANA, L. S. (UFAL) ; PLETSCH, M. (UFAL) ; LOPEZ, A. M. Q. (UFAL) ; MACHADO, S. S. (UFAL)
RESUMO: Com objetivo de desenvolver um biomarcador para monitorar contaminação por pesticidas em ambientes estuarinos, foi analisada a atividade de acetilcolinesterase em crebros de peixes da lagoa Mundaú em Alagoas-Brasil. Foram estudados cérebros de três espécies de peixes, Eugerres brasilianus (Carapeba), Magil cephialus (Tainha) e Centropomus undecimalis (Camurim), mais comuns na Lagoa Mundaú e na região Nordeste do Brasil. A atividade dos extratos livres de células representam 20 a 35% da atividade presente no extrato bruto. Estes resultados indicam a presença de duas formas de AchE no cérebro dos peixes das espécies estudadas.
PALAVRAS CHAVES: acetilcolinesterase, peixe, biomarcador
INTRODUÇÃO: A inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE; EC 3.1.1.7) por pesticidas organofosforados e carbamatos é considerado um marcador biológico específico da exposição e efeitos a estes pesticidas. Acetilcolinesterase pertence à classe das serinas hidrolases e catalisa a hidrólise da substância neurotransmissora acetilcolina nas sinapses colinérgicas e junções neuromusculares. Substâncias organofosforadas e carbamatos inibem a acetilcolinesterase por se ligarem covalentemente formando um complexo enzima-substrato muito estável que resulta na inibição da enzima. Pesticidas são amplamente utilizados no mundo. Milhões de toneladas destas substâncias são usadas anualmente na agricultura, medicina e industria. Nas regiões tropicais os inseticidas organofosforados são amplamente utilizados na agricultura e no controle de vetores da dengue e da malaria (RODRIGUES-FUENTES & col., 2000). A maioria destes são altamente tóxicos e sua acumulação nos organismos vivos podem causar distúrbios metabólicos severos. Os pesticidas organofosforados e os carbamatos estão entre os considerados mais tóxicos e são neurotóxicos. (GIACOBINI, 2000; WANG & col., 2003; QUINN, 1995).
Este trabalho visa avaliar a atividade de acetilcolinesterase no extrato bruto e no extrato livre de células do cérebro de espécies de peixes, características do nordeste do Brasil que serão coletadas em ecossistema lacustre no estado de Alagoas com a finalidade de viabilizar o emprego desta técnica de monitoramento de contaminação por pesticidas. Alagoas possui grande parte da sua economia baseada em atividades agrícolas e pesqueiras. Dentro da nova consciência ambiental, faz-se necessário à implantação de sistema de monitoramento que possa de forma rápida acompanhar a qualidade destes mananciais pesqueiros.
MATERIAL E MÉTODOS: Material: As espécies de peixes Eugerres brasilianus (Carapeba), Magil cephialus (Tainha) e Centropomus undecimalis (Camurim) usadas para este estudo foram coletadas da lagoa Mundaú no Município de Maceió. De cada espécie foram retiradas as cabeças e transportadas em nitrogênio liquido para em seguida serem acondicionadas a -20 ºC.
Extração do cérebro e preparo dos extratos: Os cérebros foram retirados, pesados e imersos em nitrogênio líquido e mantidos congelados em freezer até análise posterior. Foi adicionado na amostra cerebral solução de NaCl 0,9%. Esse material foi homogeneizado em homogeneizador de vidro. O extrato foi divido em duas partes iguais. A primeira parte foi mantida em banho de gelo. A segunda foi submetida a 3 ciclos em aparelho de ultrassom por 10s cada ciclo, com intervalos de 10s em banho de gelo. O homogeneizado de células foi centrifugado à 12000g à 4°C por 10 min usando uma centrifuga refrigerada para obtenção do extrato livre de células (fração solúvel).
A atividade de AChE: A atividade foi determinada utilizando o método de ELLMAN ET AL., (1961) num comprimento de onda de 412 nm utilizando espectrofotômetro UV/VIS. A atividade da enzima foi expressa em mmol substrato hidrolisado por grama de tecido cerebral.
Quantificação de Proteínas: A quantificação de proteína foi determinada segundo método de LOWRY et al.(1951). Em seguida, foi realizada a leitura espectrofométrica da absorvância a 725 nm. O conteúdo protéico do extrato foi expresso em mg/mL. A curva de calibração de proteínas totais foi construída empregando-se albumina de soro bovino como padrão.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Os resultados mostraram que a atividade de AChE entre os extratos brutos e extrato livre de célula variou conforme Tabela 1. Os maiores valores de proteína e atividades foram observados para os Extratos Brutos (EB). As atividades dos extratos livres de células representam 20 a 35% da atividade presente no extrato bruto (Tabela 2). Essa redução possivelmente esteja relacionado ao processo de centrifugação Estes resultados indicam a presença de duas formas de AchE no cérebro dos peixes, como observado também por OLIVEIRA et al.(2007).
CONCLUSÕES: Os resultados corroboram com os obtidos por OLIVEIRA et al.(2007), demonstrando a importância da atividade da AchE no extrato bruto. Esses resultados mostram a vantagem deste método de quantificação da atividade de acetilcolinesterase visto ser um método direto e simples sem necessitar de etapas adicionais de centrifugação.
AGRADECIMENTOS: Os autores agradecem o suporte financeiro da CAPES.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: ELLMAN, G.L., COURTNEY, K.D., ANDRES JR., V., FEATHERSTONE, R.M., 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology 7, 88–95.
GIACOBINI, E., 2000. Cholinesterases and Cholinesterase inhibitors, Martin Dunitz Publishers, London, 1-250.
LOWRY, O. H.; ROSENBROUGH, N. J.; FARR, R. L.; RANDALL, R. J.; 951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265–275.
OLIVEIRA, M. M., SILVA FILHO, M. V., BASTOS,V. L. F. C., FERNANDES, F. C., BASTOS, J. C., 2007. Brain acetylcholinesterase as a marine pesticide biomarker using Brazilian Wshes. Marine Environmental Research 63: 303–312.
QUINN, M.D., 1995. Enzymes of the Cholinesterase family, Plenum Press, New York, 1-534.
RODRIGUES-FUENTES, G. E GOLD-BOUCHOT, G. (2000). Environmental monitoring using acethylcholinesterase inhibition in vitro: A case study in two marine Mexican lagoons. Marine Environmen. Res., 50: 357-360.
WANG, J., KRAUSE, R., BLOCK, K., MUSAMEH, M., MULCHANDANI, A. E SCHÖNING, M.J. (2003). Flow injection amperometric detection of OP nerve agent based on an organophosphorus-hydrolase biosensor detector. Biosensors and Bioelectronics, 18: 255-260.
