ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: ANÁLISE QUÍMICA E GENÔMICA PARA IDENTIFICAÇÃO DE TRÊS ESPÉCIES DE FUNGOS FILAMENTOSOS DO GÊNERO ASPERGILLUS
AUTORES: GUEDES, R.I.C. (UFPA) ; COUTINHO, R.M.P. (UFPA) ; SILVA, S. (UFPA) ; SCHNEIDER, M.P. (UFPA) ; SARQUIS, M.I. (FIOCRUZ) ; SANTOS, A.S. (UFPA)
RESUMO: Este trabalho trata de aspectos científicos relacionados à investigação sistemática da produção de metabólitos em cultivos de fungos filamentosos de interesse biotecnológico e da identificação destes fungos por meio da taxonomia clássica e técnicas da biologia molecular, levando em consideração a análise filogenética dos microrganismos. A análise filogenética gerou cladogramas com clado composto por A. flavus IOC-3974 e CFAB-078 permanecido unido em 98% das vezes na máxima verossimilhança e 100% das vezes na parcimônia. A análise quantitativa demonstrou que a espécie A flavus IOC-3974 foi a que produziu em maior quantidade a substância γ-pirona, sendo esta mais evidente a partir de 216 horas de cultivo (9º dia), quando uma boa porcentagem da sacarose já havia sido consumida.
PALAVRAS CHAVES: aspergillus, biologia molecular, metabólitos
INTRODUÇÃO: Fungos filamentosos apresentam grande potencial de produção de metabólitos de interesse farmacológico e biotecnológico. Em muitos casos, os taxonomistas têm dificuldades para determinar quais são as características que realmente definem uma espécie ou um gênero (GUARRO, 1999). Nesse aspecto, técnicas moleculares (PCR-RFLPs, RAPD ou sequenciamento de genes) de classificação e identificação estão contribuindo para o entendimento das relações filogenéticas entre as diferentes espécies de fungos. Devido à mudança morfológica durante o cultivo da espécie A. flavus (IOC-3974), gerando uma nova espécie CFAB-078, optou-se por fazer uma identificação através da biologia molecular com o seqüenciamento de um fragmento nucleotídico do gene 18S e a análise das relações filogenéticas com outras unidades taxonômicas operacionais OTUs, A. tamarii (IOC-187) e A. terreus (IOC-217). Também foi quantificado a produção do metabólito secundário (5-hidroxi-2-hidrometil-γ-pirona) produzido pelas espécies e dosagem de açúcares redutores totais, visando a identificação quimiotaxonômica.
MATERIAL E MÉTODOS: Amostras de A. flavus (IOC-3974 e CFAB-078), A. tamarii (IOC-187) e A. terreus (IOC-217) foram cultivados em 100mL de meio líquido CZAPECK (pH 5,5), a 29°C e 120 RPM por 4 dias. O isolamento do DNA total dos fungos foi realizado segundo Sambrook et al., 1998 (SANTOS, 2005). A amplificação de uma seqüência de aproximadamente 580 pb do espaçador da região 18S ribossomal foi feita via PCR com volume final de 50 µL, contendo 10mM Tris HCl pH 9,0; 50mM KCl; 0,1% Triton X-100; 0,2mg/mol BSA; 3mM MgCl2; 5pmol de cada iniciador; 0,2mM de dNTPs; 0,5U de Taq e 100ng de DNA. Reações de PCR foram feitas em termociclador programado: desnaturação a 94°C por 3 min, seguida de 40 ciclos de 94°C por 1 min, 60°C por 1 min e 72°C por 1 min; e ciclo final a 72°C por 5 min. O amplicon foi purificado com auxílio do kit GFX. A clonagem foi feita em sistema PGem T vector, eletrotransformado em linhagem E. coli DH5 alfa e seqüenciado em sistema automático de análise de DNA MegaBace 1000. Análises filogenéticas foram realizadas com auxílio do pacote PAUP. Foram retiradas alíquotas de 1 mL a cada 24 horas, durante 15 dias, para análises quantitativas de 5-hidroxi-2-hidrometil-γ-pirona e açúcares redutores totais. Este procedimento teve como objetivo acompanhar o consumo do substrato e produção do metabólito e conseqüentemente identificar o dia de máxima produção deste metabólito. A quantificação do 5-hidroxi-2-hidrometil-γ-pirona no meio de cultura filtrado foi determinada por espectrofotometria UV/Vis, tendo como referência a curva de quantificação do padrão desta substância a λ=269 nm. A dosagem de açúcares redutores totais foi realizada pelo método do DNS, segundo MILLER (1959).
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Análise do seqüenciamento da subunidade 18S demonstrou ser eficiente na caracterização das amostras do gênero Aspergillus. As árvores filogenéticas geradas através do método de máxima parcimônia e agrupamento de vizinhos apresentaram estrita concordância nos arranjos envolvendo todos os OTUs, gerando cladogramas com topologias iguais. Análise de bootstrap foi realizada no banco de dados com 2000 replicas, com o clado composto por A. flavus CFAB-078 e IOC-3974 permanecido unido em 98% das vezes na máxima verossimilhança e 100% das vezes na parcimônia. As seqüências das linhagens 078, 3974, 187 e 217 foram submetidas ao GenBank para depósito e aguardam o envio da ID definitiva. Análise quantitativa para determinação de ácido kójico por espectrofotometria UV/Vis mostrou uma absorção máxima da substância a λmáx= 269 nm havendo concordância com o resultado obtido pelo padrão desta substância e conforme GOMARA et al. (2004). Os gráficos mostraram que dentre as linhagens estudadas a linhagem IOC-3974 foi a que produziu em maior quantidade a substância γ-pirona, sendo esta mais evidente a partir de 216 horas de cultivo (9º dia), quando uma boa porcentagem da sacarose já havia sido consumida. Há evidências de que no período decorrido até o início de produção do metabólito, o microrganismo direciona o seu mecanismo enzimático para produção de hidrolases e seqüencialmente de invertases para poder metabolizar os monossacarídeos presentes na sacarose (FERREIRA, 2006).
CONCLUSÕES: Este estudo viabiliza uma identificação segura de fungos filamentosos utilizados na busca de metabólitos secundários de interesse biotecnológico. Desta forma, este estudo quimio-genético-taxonômico assegura um procedimento de identificação correta da espécie estudada.
AGRADECIMENTOS: MCT, CNPq, CAPES, FINEP, pelo apoio financeiro
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: GUARRO, J.; GENE’J.; STCHIGEL, A.M. Developments in fungal taxonomy. Microbiology Reviews. 1999, 12:454-500.
SANTOS, M.S. (2005), Tese de Doutorado PA, UFPA. 210p.
MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal. Chem. 1959, v. 11, p. 426-428.
FERREIRA, N. R. (2006). Micotecnologia aplicada à produção de 5-hidroxi-2-hidroximetil- -pirona: uso potencial na indústria de alimentos Dissertação de mestrado PA, UFPA, 102p.
GOMARA, F.L.; CORRER, C.J.; SATO, M.; PONTAROLO, R. Development and validation of a spectrophotometric method for the quantification of kojic acid. Ars. Pharm. v.45, p.145-153, 2004.
