ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: Manganês peroxidases produzidas por Ceriporiopsis subvermispora durante a biodegradação de Eucalyptus grandis na presença ou ausência de co-substratos
AUTORES: CARVALHO, W. (EEL-USP) ; FERRAZ, A. (EEL-USP) ; MILAGRES, A.M.F. (EEL-USP)
RESUMO: C. subvermispora foi utilizado para a biodegradação de E. grandis na presença ou ausência de co-substratos (milhocina e glicose) durante 7, 14 e 28 dias. Os cavacos biodegradados foram utilizados para o preparo de extratos, que foram caracterizados quanto à atividade de enzimas hidrolíticas e oxidativas e aos espectros de absorção em UV-VIS. Após pré-tratamento com carvão ativado e concentração por cromatografia de troca aniônica, os extratos foram fracionados por meio de eletroforese e os perfis de proteínas produzidas nas diferentes condições experimentais foram comparados.
PALAVRAS CHAVES: eucalyptus grandis; ceriporiopsis subvermispora; manganês peroxidases
INTRODUÇÃO: A biopolpação envolve o pré-tratamento da madeira com fungos que apresentam elevada seletividade na degradação da lignina, sendo os cavacos biodegradados processados posteriormente por meio de métodos mecânicos e/ou químicos. Na polpação mecânica, o pré-tratamento biológico resulta em economia de energia. Por outro lado, na polpação química, acarreta em aumento no rendimento da polpação e redução no consumo de reagentes. Dentre os fungos que levam à “podridão branca”, Ceriporiopsis subvermispora tem se destacado para aplicação em processos industriais devido à sua elevada seletividade na degradação de lignina. Durante a biopolpação, o crescimento desse fungo pode ser estimulado pela adição de milhocina (um subproduto gerado durante a produção de amido de milho) e glicose aos cavacos, o que evita a necessidade do uso de elevadas concentrações celulares iniciais para se obter uma colonização eficiente da madeira (Vicentim e Ferraz, 2007).
MATERIAL E MÉTODOS: Os experimentos foram realizados em biorreatores de polietileno com capacidade de 20 L, contendo 2 Kg de cavacos de E. grandis. Os biorreatores foram inoculados com 500 mg de micélio de C. subvermispora por Kg de madeira (base seca), suplementados (CN) ou não (SN) com 0.5 % p/p de glicose e milhocina, e incubados a 27 °C por 7, 14 e 28 dias sob aeração a um fluxo de 23 L/h. Para a obtenção dos extratos, os cavacos biodegradados foram extraídos com tampão acetato de sódio 50 mM (pH 5.5) adicionado de 0.01 % de Tween 60, a 120 rpm e 10 °C por 4 h.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: Manganês peroxidases (MnPs) foram as principais enzimas recuperadas nos extratos, seguidas de xilanases, mananases, endoglucanases, beta-glicosidases e lacases (Tabela 1). Lignina peroxidases, celobiose desidrogenases, celobiohidrolases e beta-xilosidases não foram detectadas tanto na presença quanto na ausência de co-substratos.
Os valores de RZ dos extratos (relação entre as absorbâncias a 405 e a 280 nm) situaram-se entre 2.6 x 10-2 e 9.3 x 10-2. Considerando-se este parâmetro como uma medida da concentração de heme-peroxidases em relação àquela de compostos aromáticos (extrativos e derivados da lignina), percebe-se que as MnPs constituem uma fração muito pequena dentre todos os compostos presentes nos extratos. Em função disso, não foi possível estabelecer uma correlação entre as 3 variáveis que, pelo menos a princípio, poderiam ser utilizadas para a quantificação de MnPs: teor de proteínas, atividade de MnPs e absorbância a 405 nm.
Adsorção em carvão ativado foi utilizada com sucesso para reduzir a absorbância a 280 nm dos extratos enzimáticos. Ajustando-se a quantidade de carvão adicionada a cada um dos extratos (0.5, 1.5 e 3.0 %, e 1.0, 2.0 e 3.0 %, para os extratos SN 7, 14 e 28 dias, e CN 7, 14 e 28 dias, respectivamente), foi possível maximizar a remoção de absorbância a 280 nm sem perda de MnPs. Este pré-tratamento aumentou consideravelmente a capacidade adsortiva de uma coluna cromatográfica empacotada com resina DEAE Sepharose CL 6B, o que permitiu aumentar a atividade de MnPs por fatores entre 34 e 106 vezes durante eluição com NaCl.
CONCLUSÕES: Os extratos concentrados foram submetidos à eletroforese desnaturante, seguida por revelação com nitrato de prata. Dependendo do período de biodegradação e da presença ou ausência de co-substratos, uma ou duas bandas principais (46.8 ± 0.6 KDa e 51.6 ± 1.0 KDa) foram identificadas após revelação com nitrato de prata (Figura 1). A presença de atividade de MnPs foi confirmada por meio de eletroforese nativa, seguida por revelação com vermelho de fenol. Nestas análises, entretanto, não foi possível identificar bandas separadas após o fracionamento dos extratos CN 14 e SN 28 dias.
AGRADECIMENTOS: Fapesp, CNPq
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: Vicentim, M.P.; Ferraz, A. Enzyme and Microbial Technology. 40, 645-652, 2007.
