ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: Penicillium chrysogenum Como Agente Produtor de Enzima Com Atividade Hidrolásica de Lipídios.
AUTORES: COUTINHO, R.M.P. (UFPA) ; GUEDES, R.I.C. (UFPA) ; SANTOS,L.S. (UFPA) ; SANTOS,A.S. (UFPA) ; SARQUIS, M.I.M. (FIOCRUZ)
RESUMO: Este projeto teve como objetivo a produção de lípases a partir de uma linhagem de fungo classificada como Penicillium chrysogenum. Para o crescimento desses fungos filamentosos, obteve-se um perfil cinético, resultando em um rendimento satisfatório. Uma outra metodologia utilizada, foi aquela em meio líquido com agitação, que apresentou maior rendimento e elevada atividade lipásica. Estes métodos se mostraram adequados na produção destas enzimas. Tanto o método de dosagem de proteínas quanto o método de determinação de atividade lipásica foram otimizados para o monitoramento deste tipo de enzima. Pode-se salientar que agente o indutor (azeite de oliva) permitiu a produção de enzima com uma expressiva atividade lipásica.
PALAVRAS CHAVES: lipídeos , lípases, penicillium chrysogenuum
INTRODUÇÃO: De acordo com a literatura, muitas espécies do gênero Penicillium são notáveis produtoras de lípases e com grande potencial de aplicação em várias áreas diferentes(LLIMA, et al., 2003). Neste sentido, este trabalho visa produzir lípases a partir de uma linhagem de fungo classificada como Penicillium chrysogenum, para a qual, a melhor fonte de substrato foi investigada, e sabe-se que para fungos desse gênero, os melhores resultados, foram obtidos com fontes de nitrogênio orgânico, ou uma combinação de fontes orgânicas e inorgânicas. A otimização da produção de lípase por esta espécie microbiana em um processo biotecnológico relativamente viável e de baixo custo será o propósito principal deste trabalho. A demanda para enzimas industriais, particularmente de origem microbiana, está aumentando devido às suas aplicações em uma grande variedade de processos biotecnológicos. As reações de enzimas são alternativas atrativas aos métodos químicos de difícil realização. As enzimas são agentes bioquímicos que podem ser aplicados em diversas procuras industriais, tais como: alimentos, laticínio, farmacêutica, detergente, indústria têxtil e indústrias de cosméticos. As enzimas tais como as proteases e as amilases dominaram o mercado do mundo devido a suas reações hidrolíticas para proteínas e hidratos de carbono. Entretanto, com o potencial biocatalítico das lipases microbianas em meio aquoso e não aquoso, nas últimas décadas, as indústrias utilizaram estas enzimas com uma variedade de reações de imensa importância(SAXENA et al., 1999).
MATERIAL E MÉTODOS: Nos ensaios realizados, foi empregada uma cultura pura de Penicilium chrysogenum nº. CFAB002, proveniente do Laboratório FIOCRUZ Rio de Janeiro, cultura gentilmente fornecida da coleção de cultura da Dra. Maria M. Sarquis. A cultura estava preservada em óleo mineral, posteriormente conservada em tubos de ensaio contendo meio BDA. Nos ensaios realizados, foi empregada uma cultura pura de Penicilium chrysogenum proveniente do Laboratório FIOCRUZ Rio de Janeiro, cultura gentilmente fornecida da coleção de cultura da Dra. Maria Inez Sarquis. A cultura estava preservada em óleo mineral, posteriormente conservada em tubos de ensaio. Todos os demais microorganismos isolados foram preservados em óleo mineral e mantidos em tubos de ensaio 11mm x 150mm. Nos ensaios realizados em agitador orbital, foi utilizado um meio de cultura líquido contendo azeite de oliva como principal fonte indutora de lípase e variando a concentração. Nos cultivos em agitador orbitalar foi utilizado um meio de cultura líquido adaptado de uma patente. Em frascos de Erlenmeyers de 250mL, com 100 mL de meio distribuídos em cada frasco. Os frascos de Erlenmeyers foram fechados com rodilhões de algodão e gaze, e esterilizados em autoclave à 120°C por 15 minutos. As curvas de crescimento foram iniciadas usando-se inóculos à 0,2; 0,4; 0,6; 1,0; e 2,0%(v/v). O sistema foi incubado a 29°C com agitação à 120rpm durante 15 dias. A cada 24 horas, alíquotas foram retiradas assepticamente e filtradas em seringa de 1mL com filtro de algodão. Os filtrados brutos dos meios de cultura foram utilizados para as seguintes determinações: atividade lipásica, concentração de proteínas, determinação da biomassa.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: A melhor produção de lípase de penicilliun chrysogenum (12420 µmol/min) se deu após 9 dias de cultivo utilizando o meio BOB modificado(MAHADIK et al., 2003). O melhor meio de cultura líquido utilizado para produzir lípase de Penicillium chrysogenum, foi o meio B.O.B.(Tomorrow”s Technology, Today), que apresentou uma atividade de 12896,4 U/mL após 9 dias e cultivo. Na realização destes ensaios foram utilizadas cinco diferentes concentrações de esporos na inoculação dos frascos cultivados em agitador orbital, como As concentrações foram todas retiradas de uma mesma suspensão obedecendo as mesmas condições de ensaio A lípase de P. chrysogenum, produzida no meio BOB, foi ativa numa ampla faixa de temperatura entre 25ºC à 45ºC, com máxima atividade à 30ºC. Este resultado se compara com o encontrado por BANCERZ et al.(2005) que disse que o efeito da temperatura na atividade lipásica foi estudado por passos de reações enzimáticas em diferentes temperaturas num range de 10 a 50ºC à pH 7,0, usando 50mM de tampão fosfato. E que a termoestabilidade da lípase foi determinada por pré-incubação da enzima por 60 minutos em temperaturas que variaram entre 20ºC e 70ºC, onde então a atividade foi medida a 30ºC depois da adição do substrato e a atividade residual foi calculada nesta temperatura e tida como 100%. MAHADIK et al..(2003), também estudou o efeito da temperatura na atividade da enzima por incubação do ensaio da mistura à temperaturas que variaram entre 30ºC à 70ºC por 20 minutos. Ele observou que a enzima foi ativa numa ampla faixa de temperatura entre 35ºC a 60ºC, com máxima atividade à 45ºC.
CONCLUSÕES: Diversos ensaios foram realizados neste estudo, com a indução do azeite de oliva na concentração de 2%, o que permitiu a produção de enzimas lipolíticas no meio de cultura. O resultado apresentou alta atividade, o que foi permitido pela melhor aeração no meio de cultura. Desta forma, pode-se afirmar que esta estratégia permitiu produzir um concentrado de enzimas com atividade lipásica a qual será estudada com vistas na aplicação de hidrólise de óleos para obtenção de ácidos graxos. Estes estudos direcionam para a otimização de um processo biotecnológico de produção de lípases extracelulares.
AGRADECIMENTOS: MCT, CNPq, CAPES, FINEP, pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: Lima, V. M. G. et al. Effect of Nitrogen and Carbon Sources on Lípase Production by Penicillium aurantiogriseum. Food Technol. Biotechnol. 2003 41(2) 105-110.
Ratusznei, S.M.; Suazo, C.A.T. Inducing controlled growth of Penicillium chrysogenum in pelletized form. In: GALINDO, E..; 3Ramires, O.T., ed. Advances in Bioprocess Engineering, Kluwer Academic Publishers, 1994, p.203-206.
Ferrer et al. Production of Native and Recombinant Lipases by Candida rugosa. Aplied Biochemistry and Biotechnology. Vol.95,2001
