ÁREA: Bioquímica e Biotecnologia
TÍTULO: ORIENTAÇÃO DE ANTICORPOS EM FILMES DE ALUMÍNIO EMPREGANDO MONOCAMADAS AUTO-ORGANIZADAS PARA DESENVOLVIMENTO DE IMUNOSSENSORES
AUTORES: SANTOS, R. F. R. (UFPE) ; MATTOS, A. B. (UFPE) ; SILVA, J. A. (UPE) ; CAVALCANTI, I.T. (UFPE) ; PEREIRA, C.O. (UPE) ; VASCONCELOS, E.A. (UFPE) ; DUTRA, R.F. (UPE) ; SILVA, V.L. (UFPE)
RESUMO: RESUMO: Imunossensor é um dispositivo que utiliza um anticorpo/antígeno imobilizado a um transdutor o qual converte um sinal biológico num sinal elétrico. A utilização de monocamadas auto-organizadas – SAMs tem como vantagem favorecer alta organização e ligações irreversíveis com a superfície sensora da biomolécula imobilizada. O objetivo deste trabalho foi utilizar SAMs para imobilizar anticorpos em filmes de alumínio visando o desenvolvimento de sensores mais baratos. Dois métodos de imobilização foram testados: via Ácido-mercaptopropiônico (MPA) e via Aminoetanotiol (AET). A imobilização via AET apresentou melhor resultado na imobilização de anticorpos em filmes de alumínio evaporados sobre Si/SiO2 na construção de sensores com detecção em tempo real.
PALAVRAS CHAVES: imunossensor; monocamada auto-organizada; alumínio
INTRODUÇÃO: INTRODUÇÂO: Uma das etapas críticas na construção de imunossensores envolve o processo de imobilização do bioreceptor à superfície sensora (BAE, et al., 2005). Recentemente, o emprego de metais de menor custo vêm sendo testados na produção de sensores ópticos, acústicos e impedimétricos e que dispensam o uso de substâncias marcadoras - anticorpos conjugados (RAHMAN et al, 2007). Filmes delgados de alumínio evaporados sobre semicondutores (Si/SiO2/Al) vêm apresentado bons resultados como filmes sensores em substituição aos filmes de ouro, prata e platina. Neste sentido, o desenvolvimento de metodologias de imobilização orientada de biomoléculas em alumínio proporcionam maior sensibilidade e especificidade diagnóstica aos dispositivos (BULUKIN et al., 2007). A modificação de superfícies sensoras por monocamadas auto-organizadas (SAMs) vêm sendo empregadas no desenvolvimento de biossensores devido a sua homogeneidade, facilidade de preparação, possibilidade de variar tanto o comprimento das cadeias quanto de grupos funcionais, além de proteção das moléculas imobilizadas. De acordo com o mecanismo de fixação sobre a superfície as SAMs podem envolver mecanismos de silanização, filmes de Langmuir-Blodgett ou alcanotióis. Este trabalho desenvolveu SAMs em superfície sensora metálicas de alumínio (Si/SiO2/Al) de modo a promover uma melhor orientação de imunoglobulinas G (IgG) em sistemas sensores empregando filmes de alcanotióis.
MATERIAL E MÉTODOS: MATERIAIS E MÉTODOS: Filmes de alumínio evaporados sobre Si/SiO2 medindo área aproximada de 3 mm2 foram usados para imobilizar a IgG preparada em tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4. Dois métodos de imobilização foram testados: via Ácido-mercaptopropiônico (MPA) e via Aminoetanotiol (AET). No primeiro método, os suportes (Si/SiO2/Al) foram incubados numa solução de MPA (10mM) por 2 h, seguidos por imersão em uma mistura de N-hidróxido de succinimida 0,2M/ 1-etil-dimetilaminopropil carbodiimida 0,1M (1:1) por 1 h. No segundo método, os suportes foram incubados em solução de 25mM de AET por 2h e Glutaraldeído 2,5% (v/v). Após a preparação das SAMs, os anticorpos preparados em PBS foram imobilizados por 1h. Após esta etapa, as superfícies foram bloqueadas com solução de Albumina de Soro Bovino (BSA) 1% (w/v) “overnight”. A avaliação dos métodos foi realizada mediante imunoensaio enzimático (ELISA) com absorbâncias medidas a 490nm, após a incubação com um anti-IgG conjugado à peroxidase. Efeitos da concentração de anti-IgG (0,1; 0,5; 1 e 2 ug/ml) e estudos cinéticos quanto ao pH (7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5) e temperatura de incubação (4,0; 16,0; 27,0; 37 oC) foram realizados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO: RESULTADOS E DISCUSSÕES: A modificação da superfície sensora metálica de alumínio (Si/SiO2/Al) e o processo de imobilização do IgG esta ilustrado na Fig.1. Os estudos comparativos das SAMs em superfície sensora metálica de alumínio (Si/SiO2/Al) empregando filmes de alcanotióis mostraram que comparando os métodos de imobilização via AET e via MPA (Fig.2), o método via AET apresentou resultados superiores em 69,9% em relação aos valores de absorbâncias dos encontrados por via MPA, indicando maior quantidade de IgG imobilizado e maior imunorreatividade observada pelas absorbâncias medidas, mostrando baixo impedimento estérico da biomolécula (HUANG et al., 2005). A imobilização via AET foi então selecionada e estudos de determinação de zona de equivalência mostraram que a concentração de 0,1ug/ml de anticorpos IgG imobilizados foi ideal como resposta à quantidade de antígenos ofertados. No pH 9.5, houve maior imunorreatividade que nos demais pHs testados, correspondendo assim a uma melhor orientação do IgG imobilizado. Na temperatura de 37oC foi alcançado um aumento aproximado de 10% na imunorreatividade quando plotadas as curvas termodinâmicas.
CONCLUSÕES: CONCLUSÕES: A imobilização orientada de IgG utilizando SAMs de aminoetanotiol-glutaraldeído mostrou-se viável abrindo perspectivas no desenvolvimento de sensores mais baratos que empregam o alumínio como filme metálico em substituição aos de custos mais elevados (ex: ouro). O emprego de SAM tem a vantagem de proporcionar maior sensibilidade e especificidade diagnóstica aos dispositivos visto que permite maior homogeneidade, menor impedimento estérico pela possibilidade de variar tanto o comprimento das cadeias quanto de grupos funcionais, além de proteção das moléculas imobilizadas.
AGRADECIMENTOS: AGRADECIMENTOS: À FACEPE e CAPES pelo suporte financeiro.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA: REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS: BAE, M.Y.; OH, B.K.; LEE, W.; WON, H.L.; CHOI, J.W. 2005. Study on orientation of immunoglobulin G on protein G layer. Biosensors and Bioelectronics, 21:103-110.
RAHMAN, M.A; SHIDDIKY, M.J.A; PARK, J.S.; SHIM, Y.B. 2007. An impedimetric immunosensor for the label-free detection of bisphenol A. Biosensors and Bioelectronics, 22:2464-2470.
BULUKIN, E; MEUCCI, V.; MINUNNI, M.; PRETTI, C.; INTORRE, L.; SOLDANI,G.; MASCINI,M. 2007. An optical immunosensor for rapid vitellogenin detection in plasma from carp (Cyprinus carpio). Talanta, 72:785-790.
HUANG, L.; REEKMANS, G.; SAERENS, D.; FRIEDT, J.M.; FREDERIX, F.; FRANCIS, L.; MUYLDERMANS, S.; CAMPITELLI, A; HOOF, C.V. 2005. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosensor and Bioeletronics, 21:483-490.
